[發明專利]一種膠基型煙草制品對變形鏈球菌影響的檢測方法

在審

• 申請號: 201710988323.X
• 申請日: 2017-10-21
• 公開（公告）號: CN107513581A
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發明（設計）人: 夭建華;高茜;徐玉瓊;陸舍銘;管瑩;朱洲海;米其利;李雪梅
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12R1/46
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司53100
• 代理人: 金耀生,于洪

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種膠基型煙草制品對變形鏈球菌影響的檢測方法。

背景技術

齲病被世界衛生組織(WHO)列為嚴重危害人類健康的流行性感染性疾病之一，是在細菌等多種因素共同作用下，牙齒硬組織發生的慢性、進行性、破壞性疾病。致齲的因素包括：細菌、食物、宿主和作用時間等。口腔內細菌種類甚多，其中主要是厭氧菌和兼性厭氧菌，包括鏈球菌屬、乳桿菌屬和放線菌屬等。變形鏈球菌在口腔中檢出率高，接近90％，是主要的致齲菌，它通過黏附、產酸和耐酸等致使牙體硬組織破壞，從而導致齲齒的形成。

膠基型無煙氣煙草制品(Tobacco chewing gum)是一種在膠基中加入了一定量的煙草提取物、香料以及其他一些食用添加劑制成的一種口用無煙氣煙草制品。膠基型煙草制品的使用方式是放入口中咀嚼，咀嚼的溶出物會與唾液匯合聚集在口腔中，根據消費習慣的不同吐出或者咽下。在產品使用的過程中，產品對人口腔健康的影響是一個重要考察指標。目前的煙草制品僅針對產品本身進行一些物理化學指標的檢測，而對人口腔中的微生物影響研究較少，尤其是針對口腔中變形鏈球菌的研究未曾涉及。因此如何克服現有技術的不足是目前生物檢測技術領域亟需解決的問題。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種膠基型煙草制品對變形鏈球菌影響的檢測方法，該方法首先配制含有變形鏈球菌的人工唾液，并針對膠基型產品的使用特點，采用全仿真模擬咀嚼機來模擬膠基型煙草制品的咀嚼過程，對咀嚼過程中唾液的變形鏈球菌含量進行熒光定量PCR分析，從而考察在使用膠基型煙草制品前后唾液中的變形鏈球菌含量的變化，為膠基型煙草制品的口腔健康提供參考。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種膠基型煙草制品對變形鏈球菌影響的檢測方法，包括如下步驟：

步驟(1)，配制人工唾液，并向人工唾液中添加變形鏈球菌，使變形鏈球菌在人工唾液中的量為1*10^4-1*10⁶CFU/mL，得到含變形鏈球菌的人工唾液，編號為1#液體；

步驟(2)，將膠基型煙草制品放入模擬咀嚼機中，并分多次注入步驟(1)的含變形鏈球菌的人工唾液，進行人工咀嚼，咀嚼過程中，收集不同咀嚼時間點的唾液；

步驟(3)，將步驟(2)收集到的不同咀嚼時間點的唾液與步驟(1)的含變形鏈球菌的人工唾液一起放入厭氧培養箱于37℃下進行共培養；之后分別提取各時間點培養液中的變形鏈球菌DNA，同時提取變形鏈球菌的標準菌株原始DNA；

步驟(4)，以濃度梯度稀釋10倍的變形鏈球菌的標準菌株原始DNA作為模板進行熒光定量PCR分析，之后繪制變形鏈球菌熒光定量PCR標準曲線；

同時，分別以各時間點培養液中的變形鏈球菌DNA作為模板進行熒光定量PCR分析，空白對照模板采用滅菌雙蒸水，根據標準曲線計算各時間點培養液中變形鏈球菌含量；

其中，熒光定量PCR反應所使用的上游引物為5’-gcctacagctcagagatgctattct-3’；下游引物為5’-gccatacaccactcatgaattga-3’；探針為FAM-tggaaatgacggtcgccgttatgaa-TAMRA。

進一步，優選的是，步驟(2)的具體方法為：

將0.8-1.2g膠基型煙草制品放入全仿真模擬咀嚼機的溶液皿中，注入步驟(1)的含變形鏈球菌的人工唾液10mL，進行人工咀嚼；設置咀嚼機械齒以5秒一次的頻率進行上下咬合且左右磨錯動作，共20次，咬合寬度為15mm；同時，啟動左右開合旋轉組件，每隔4次上下咬合且左右磨錯動作做一次聚攏翻滾動作，每次聚攏翻滾夾板的旋轉角度為45°；完成后收集溶液皿中的液體，編號為2#液體；

第二次再注入步驟(1)的含變形鏈球菌的人工唾液10mL，進行人工咀嚼；設置咀嚼機械齒以10秒一次的頻率進行上下咬合且左右磨錯動作，共10次，咬合寬度為10mm；同時，啟動左右開合旋轉組件，每隔5次上下咬合且左右磨錯動作做一次聚攏翻滾動作，每次聚攏翻滾夾板的旋轉角度為30°；完成后收集溶液皿中的液體，編號為3#液體；

第三次再注入步驟(1)的含變形鏈球菌的人工唾液10mL，進行人工咀嚼；設置咀嚼機械齒以5秒一次的頻率進行上下咬合且左右磨錯動作，共30次，咬合寬度為8mm；同時，啟動左右開合旋轉組件，每隔5次上下咬合且左右磨錯動作做一次聚攏翻滾動作，每次聚攏翻滾夾板的旋轉角度為90°；完成后收集溶液皿中的液體，編號為4#液體。