[發(fā)明專利]一種卷煙煙氣對細胞水滲透性影響的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710988307.0
• 申請日: 2017-10-21
• 公開（公告）號: CN107764716B
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高茜;管瑩;曾婉俐;米其利;夭建華;張濤;朱洲海;陸舍銘;徐玉瓊
• 申請（專利權(quán)）人: 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號: G01N15/08
• 分類號: G01N15/08
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 金耀生;于洪

本發(fā)明涉一種卷煙煙氣對細胞水滲透性影響的檢測方法，屬于生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用生物化學(xué)及細胞學(xué)方法，利用BMP6處理細胞，模擬了干燥綜合癥發(fā)生時的細胞微環(huán)境，從而研究卷煙煙氣對水滲透性的影響，相較于動物實驗而言更為簡單、高效；在卷煙煙氣的捕集上采用了口腔仿生模擬裝置，更貼合實際的人抽吸狀態(tài)；同時采用了高內(nèi)涵系統(tǒng)，可在不同時間點同時檢測多個樣品對細胞水滲透性的影響，可快速準確可視的進行多樣品檢測，為卷煙煙氣的功效性評價提供了一個新的快速手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種卷煙煙氣對細胞水滲透性影響的檢測方法。

背景技術(shù)

唾液是維持口腔微生態(tài)環(huán)境平衡的主要因素，具有濕潤口腔和食物、便于說話吞咽、移走味蕾上的食物微粒，從而不斷嘗到食物上的味道以及清潔和保護口腔等多種作用。卷煙感官評價表明部分卷煙煙氣會引起口腔干澀、燥刺、不適等負面感受，因此研發(fā)具有降燥生津功能的卷煙產(chǎn)品，對于改善口腔舒適感提升卷煙抽吸品質(zhì)具有重要意義。

水通道蛋白家族(Aquaporins，AQP)是特異性跨膜轉(zhuǎn)運水的一組蛋白，能顯著增加細胞膜水滲透性，參與水的分泌、吸收及細胞內(nèi)外水的平衡。AQP5是一種主要表達于唾液腺及皮膚小汗腺的水通道蛋白，主要介導(dǎo)水分子跨細胞膜通透轉(zhuǎn)運，在唾液分泌中起著重要作用。研究表明干燥綜合癥患者及干燥綜合癥模型小鼠涎腺細胞中存在AQP5的下調(diào)或亞細胞分布異常，從而導(dǎo)致細胞水滲透性失調(diào)。目前，已有的研究發(fā)現(xiàn)低滲環(huán)境容易造成一些細胞形態(tài)的改變，在傳統(tǒng)熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下導(dǎo)致體積測量困難，操作繁瑣，且不利于大批量樣品的檢測。因此如何通過高通量的方法來進行卷煙煙氣對細胞水滲透性的檢測對生津物質(zhì)的開發(fā)起著重要作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種卷煙煙氣對細胞水滲透性影響的檢測方法，該方法利用BMP6處理細胞，模擬了干燥綜合癥發(fā)生時的細胞微環(huán)境，從而研究卷煙煙氣對水滲透性的影響，相較于動物實驗而言更為簡單、高效。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種卷煙煙氣對細胞水滲透性影響的檢測方法，包括如下步驟：

步驟(1)，采用專利申請?zhí)枮?01520354840.8的一種用于研究主流煙氣暴露于口腔中的仿生吸收裝置，采用DMEM/F12細胞培養(yǎng)基浸潤該裝置的模擬人工口腔黏膜內(nèi)壁；選取10-20支重量和吸阻一致的煙支作為待檢測樣品，平衡后進行抽吸，抽吸結(jié)束后，取出仿生吸收裝置的瓶體中的液體，得到仿生抽吸液體；

步驟(2)，將涎腺腺樣囊性癌細胞經(jīng)0.25％胰酶消化后，以2-4×10⁴個/mL細胞濃度接種于含有DMEM/F12細胞培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)板上，在37℃、5％CO₂的條件下培養(yǎng)22-26h后，加入骨形成蛋白6至終濃度為6ng/ml，處理2-3d；

步驟(3)，移去步驟(2)中的培養(yǎng)上清，以步驟(1)得到的仿生抽吸液體稀釋4-8倍后的液體作為培養(yǎng)基繼續(xù)在37℃、5％CO₂的條件下對細胞進行培養(yǎng)22-26h；仿生抽吸液體的用量與細胞之間的比例沒有限制，按照培養(yǎng)基的常用量使用即可；

步驟(4)，培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，加入含10μM熒光鈣黃綠素的DMEM/F12細胞培養(yǎng)基，室溫孵育9-11min；

步驟(5)，棄上清，將細胞置于150mOsm低滲液中進行處理9-11min，再換成等滲液，用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)對細胞進行FTIC通道的掃描，設(shè)置為每5-10s掃描一次，掃描多次；

步驟(6)，使用高內(nèi)涵分析軟件對步驟(5)所得到的圖片進行分析，計算不同時間點掃描圖片的平均細胞熒光面積；之后按以下公式計算調(diào)節(jié)性容積回縮值RVD：

RVD(％)＝(Vmax-Vmin)÷(Vmax-V0)×100 式(Ⅰ)