[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)燕麥屬植物染色體的探針組、試劑盒及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710985245.8
• 申請(qǐng)日: 2017-10-20
• 公開（公告）號(hào): CN107574229B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅小梅;周永紅;陳亮;萬(wàn)文林;劉俊成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6841
• 分類號(hào): C12Q1/6841;C12N15/11
• 代理公司: 成都天匯致遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51264
• 代理人: 韓曉銀

1.一種用于檢測(cè)燕麥屬植物染色體的探針組，其特征在于，包括Aml、(ACT)₆、(GAA)₆、(TTG)₆四種探針，其中所述Aml探針由51個(gè)堿基對(duì)組成，其堿基序列為：5′- GATCCATGTGTGGTTTGTGGAAAGAACACACATGCAATGACTCTAGTGGTT -3′，用于特異性識(shí)別燕麥屬C基因組所有染色體；所述(ACT)₆探針的堿基序列為：5′- ACTACTACTACTACTACT -3′，用于識(shí)別偏好C基因組部分染色體的部分結(jié)構(gòu)，也微弱識(shí)別A染色體組部分染色體的部分結(jié)構(gòu)；所述(GAA)₆探針的堿基序列為：5′- GAAGAAGAAGAAGAAGAA -3′，用于識(shí)別偏好A和C基因組部分染色體的部分結(jié)構(gòu)；所述(TTG)₆探針的堿基序列為：5′- TTGTTGTTGTTGTTGTTG -3′，用于識(shí)別偏好A基因組部分染色體部分結(jié)構(gòu)，微弱識(shí)別C基因組部分染色體的部分結(jié)構(gòu)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)燕麥屬植物染色體的探針組，其特征在于，所述Aml探針采用FAM或者TAMRA標(biāo)記其序列的5’端。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)燕麥屬植物染色體的探針組，其特征在于，所述(ACT)₆探針采用FAM或者TAMRA標(biāo)記其序列的5’端。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)燕麥屬植物染色體的探針組，其特征在于，所述(GAA)₆探針采用FAM或者TAMRA標(biāo)記其序列的5’端。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)燕麥屬植物染色體的探針組，其特征在于，所述(TTG)₆探針采用FAM或者TAMRA標(biāo)記其序列的5’端。

6.一種用于檢測(cè)燕麥屬植物染色體的試劑盒，其特征在于，包括：

（1）權(quán)利要求1~5任意一項(xiàng)所述的探針組；

（2）酶解液；

（3）4%多聚甲醛液；

（4）2×SSC緩沖液；

（5）70%FA液；

（6）雜交液；

所述雜交液由等體積的1×TE和2×SSC緩沖液組成；其中1×TE的配制方法為：每800mL的ddH₂O中加入1.211g Tris和0.372g EDTANa₂?2H₂O，用HCl調(diào)pH到8.0，定容到1000mL，滅菌后即得。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種用于檢測(cè)燕麥屬植物染色體的試劑盒，其特征在于，所述酶解液的配制方法為：每1mL的檸檬酸緩沖液中加入0.04g纖維素酶和0.02g果膠酶；其中檸檬酸緩沖液的配制方法為：每50mL的ddH₂O加0.5707g檸檬酸三鈉和0.4324g檸檬酸。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種用于檢測(cè)燕麥屬植物染色體的試劑盒，其特征在于，所述2×SSC緩沖液的配制方法為：每1000mL的ddH₂O加入8.823g檸檬酸三鈉和17.532g氯化鈉。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種用于檢測(cè)燕麥屬植物染色體的試劑盒，其特征在于，所述70%FA液由去離子甲酰胺(FA)和2×SSC緩沖液按照體積比7:3組成。

10.一種用于檢測(cè)燕麥屬植物染色體的方法，是采用權(quán)利要求6~9任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的試劑盒，其特征在于，包括以下步驟：

1）燕麥屬植物染色體載玻片標(biāo)本的制備：將燕麥屬植物種子用雙蒸水浸泡，置于4℃環(huán)境中放置24h，吸去多余水分，并于22℃恒溫培養(yǎng)，待根尖長(zhǎng)至1.5～2.0cm時(shí)，剪取1～1.5cm根尖組織，依次用N₂O處理5h、冰醋酸處理5min，然后置于75%酒精中于-20℃保存；

將低溫保存的根尖組織以雙蒸水清洗后切取根尖分生組織1～2mm，置于酶解液中于37℃酶解45min，去除酶解液，依次用雙蒸水、75%酒精、95%酒精、100%酒精清洗根尖分生組織后室溫晾干；在根尖組織中加入冰醋酸制成懸浮液；將懸浮液滴于載玻片上室溫晾干后鏡檢，鏡檢良好的玻片于-20℃保存；

2）熒光原位雜交：將載玻片置于4%多聚甲醛中處理10min，然后用2×SSC緩沖液處理兩次，每次5min，再依次用75%酒精、95%酒精、100%酒精梯度處理，每次5min，室溫晾干后滴加70%FA液，蓋上蓋玻片，于80℃變性2min；

載玻片變性完成后于5s內(nèi)依次放入-20℃的75%酒精、95%酒精、100%酒精梯度處理，每次5min，室溫晾干；在晾干的載玻片上滴加放有探針的雜交液，每張載玻片滴加10μL放有探針的雜交液，其中每種探針含有0.5μL，剩余為雜交液；蓋上蓋玻片，于黑暗條件下在雜交盒中于37℃恒溫孵化1.5～2h；

將孵化完成的載玻片在避光條件下依次用2×SSC緩沖液清洗3min、雙蒸水清洗2min，室溫晾干；

3）信號(hào)檢測(cè)：晾干后的載玻片上加入DAPI，蓋上蓋玻片，采用熒光顯微鏡對(duì)載玻片進(jìn)行檢測(cè)，采集檢測(cè)圖像；

4）載玻片回收：信號(hào)采集之后回收制片并放入2×SSC緩沖液中于60℃水浴5min，依次在75%酒精、95%酒精、100%酒精中梯度處理，每次5min，處理完成后將回收制片于日光燈下放置12h；-20℃保存以備下次使用。