[發明專利]一種快速檢測黃牛CRABP2基因單核苷酸多態性的方法及其專用試劑盒有效
| 申請號： | 201710985234.X | 申請日： | 2017-10-20 |
| 公開（公告）號： | CN107513579B | 公開（公告）日： | 2020-01-10 |
| 發明（設計）人： | 黃永震;文逸凡;鄭立;張子敬;張桂民;徐嘉威;李繼超;雷初朝;黨瑞華;藍賢勇;陳宏 | 申請（專利權）人： | 西北農林科技大學 |
| 主分類號： | C12Q1/6888 | 分類號： | C12Q1/6888;C12N15/11 |
| 代理公司： | 61200 西安通大專利代理有限責任公司 | 代理人： | 范巍 |
| 地址： | 712100 陜*** | 國省代碼： | 陜西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 快速 檢測 黃牛 crabp2 基因 核苷酸 多態性 方法 及其 專用 試劑盒 | ||
1.一種檢測黃牛CRABP2基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于：包括以下步驟：
以黃牛基因組DNA為模板，以引物對P1和P2為引物，分別擴增CRABP2基因的部分片段a和b，將片段a對應的擴增產物經限制性內切酶Apa I消化后進行瓊脂糖凝膠電泳，將片段b對應的擴增產物經限制性內切酶Sal I消化后進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳結果鑒定黃牛CRABP2基因的單核苷酸多態性位點的基因型；
所述黃牛CRABP2基因的單核苷酸多態性位點分別為牛CRABP2基因參考基因組序列AC_000160.1的第2458位的G或T的單核苷酸突變位點和第3878位的G或A的單核苷酸突變位點；牛CRABP2基因參考基因組序列AC_000160.1的第2458位TT和GT以及第3878位AA基因型為秦川牛體高和十字部高早期選擇的分子育種基因標記；
所述第2458位位于引物對P1擴增的區域內，引物對P1的序列為：
上游引物F1：5’-CCAGAGGAGCCTGTGGGTTAT-3’
下游引物R1：5’-AATCCCCTTTCCCCTTGGC-3’
所述第3878位位于引物對P2擴增的區域內，引物對P2的序列為：
上游引物F2：5’-GGTGGACAAAGGACCAAAAGTG-3’
下游引物R2：5’-AGCCACCGTTGTTCTTAAATT-3’。
2.如權利要求1所述一種檢測黃牛CRABP2基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于：所述擴增采用的PCR反應體系包括10ng/μL模板DNA 1μL以及10pmol/L的引物對P1或引物對P2所對應的上、下游引物各0.5μL。
3.如權利要求1所述一種檢測黃牛CRABP2基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于：所述擴增采用的PCR反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸30～60s，32個循環；72℃延伸10min。
4.如權利要求1所述一種檢測黃牛CRABP2基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于：所述瓊脂糖凝膠的質量濃度為2.5％。
5.如權利要求1所述一種檢測黃牛CRABP2基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于：所述限制性內切酶Apa I的酶切體系包括擴增產物5μL以及50U/μL Apa I 0.3μL，酶切條件為于25℃消化12～16h；限制性內切酶Sal I的酶切體系包括擴增產物5μL以及20U/μL SalI0.3μL，酶切條件為于37℃消化12～16h。
6.如權利要求1所述一種檢測黃牛CRABP2基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于：根據限制性內切酶Apa I消化后進行的瓊脂糖凝膠電泳的結果判定黃牛CRABP2基因與片段a對應區域內的單核苷酸多態性為：GG基因型表現為284bp和88bp的兩條條帶，GT基因型表現為284bp、88bp和372bp的三條條帶，TT基因型表現為372bp的一條條帶；根據限制性內切酶Sal I消化后進行的瓊脂糖凝膠電泳的結果判定黃牛CRABP2基因與片段b對應區域內的單核苷酸多態性為：GG基因型表現為269bp和705bp的兩條條帶；GA基因型表現為269bp、705bp和974bp的三條條帶；AA基因型表現為974bp的一條條帶。
7.一種如權利要求1所述的檢測黃牛CRABP2基因單核苷酸多態性的方法在黃牛分子標記輔助選擇育種中的應用，其特征在于：牛CRABP2基因參考基因組序列AC_000160.1的第2458位TT和GT以及第3878位AA基因型為秦川牛體高和十字部高早期選擇的分子育種基因標記。
8.一種檢測黃牛CRABP2基因單核苷酸多態性的試劑盒，其特征在于：包括基于PCR-RFLP法對作為秦川牛體高和十字部高早期選擇的分子育種基因的位于牛CRABP2基因參考基因組序列AC_000160.1的第2458位的G或T的單核苷酸突變位點和第3878位的G或A的單核苷酸突變位點進行基因分型的PCR擴增引物對P1和P2，以及限制性內切酶Apa I和Sal I；
所述第2458位位于引物對P1擴增的區域內，引物對P1的序列為：
上游引物F1：5’-CCAGAGGAGCCTGTGGGTTAT-3’
下游引物R1：5’-AATCCCCTTTCCCCTTGGC-3’
所述第3878位位于引物對P2擴增的區域內，引物對P2的序列為：
上游引物F2：5’-GGTGGACAAAGGACCAAAAGTG-3’
下游引物R2：5’-AGCCACCGTTGTTCTTAAATT-3’。
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