[發(fā)明專利]竹葉花椒中期染色體的熒光原位雜交方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710985222.7
• 申請(qǐng)日: 2017-10-20
• 公開（公告）號(hào): CN107557491B
• 公開（公告）日: 2020-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅小梅;陳亮;萬文林;龔偉;王景燕;劉俊成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895
• 代理公司: 成都天匯致遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51264
• 代理人: 韓曉銀

1.竹葉花椒中期染色體的熒光原位雜交方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）竹葉花椒中期染色體載玻片標(biāo)本的制備：將竹葉花椒幼苗采用營養(yǎng)土培養(yǎng)，待根尖長至1.5～2.0cm時(shí)，剪取1～1.5cm根尖組織，依次用N₂O處理3h、冰醋酸處理5min，然后置于75%酒精中于-20℃保存；

將低溫保存的根尖組織以雙蒸水清洗后切取根尖分生組織1～2mm，置于酶解液中于37℃酶解55min，去除酶解液，依次用雙蒸水、75%酒精、95%酒精、100%酒精清洗根尖分生組織后室溫晾干；在根尖組織中加入冰醋酸制成懸浮液；將懸浮液滴于載玻片上室溫晾干后鏡檢，鏡檢良好的玻片于-20℃保存；

2）熒光原位雜交：將載玻片置于4%多聚甲醛中處理10min，然后用2×SSC緩沖液處理兩次，每次5min，再用雙蒸水處理兩次，每次5min，再依次用75%酒精、95%酒精、100%酒精梯度處理，每次5min，室溫晾干后滴加70% FA液，蓋上蓋玻片，于80℃變性2min；

載玻片變性完成后于5s內(nèi)依次放入-20℃的75%酒精、95%酒精、100%酒精梯度處理，每次5min，室溫晾干；在晾干的載玻片上滴加放有探針的雜交液，蓋上蓋玻片，于黑暗條件下在雜交盒中于37℃恒溫孵化1.5～2h；所述探針采用5S rDNA探針和(GAA)₆探針，其中5SrDNA探針的堿基序列為：5′ -TCAGAACTCCGAAGTTAAGCGTGCTTGGGCGAGAGTAGTAC- 3′，采用FAM標(biāo)記其序列的5’端；(GAA)₆探針的堿基序列為：5′ -GAAGAAGAAGAAGAAGAA- 3’， 采用TAMRM標(biāo)記其序列的5’端；

將孵化完成的載玻片在避光條件下依次用2×SSC緩沖液清洗3min、雙蒸水處理兩次，每次5min，室溫晾干；

3）信號(hào)檢測(cè)：晾干后的載玻片上加入DAPI，蓋上蓋玻片，采用熒光顯微鏡對(duì)載玻片進(jìn)行檢測(cè)，采集檢測(cè)圖像；

4）載玻片回收：之后回收制片并放入2×SSC緩沖液中于60℃水浴5min，依次在75%酒精、95%酒精、100%酒精中梯度處理，每次5min，處理完成后將回收制片于日光燈下放置12h；-20℃保存。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹葉花椒中期染色體的熒光原位雜交方法，其特征在于，所述酶解液的配制方法為：每1mL的檸檬酸緩沖液中加入0.04g纖維素酶和0.02g果膠酶；其中檸檬酸緩沖液的配制方法為：每50mL的ddH₂O加0.5707g檸檬酸三鈉和0.4324g檸檬酸。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹葉花椒中期染色體的熒光原位雜交方法，其特征在于，所述4%多聚甲醛液的配制方法為：每100mL的1×PBS緩沖液加入4g多聚甲醛，在60℃水浴鍋中水浴2～3h，其中所述1×PBS緩沖液的配制方法為：每1000mL的ddH₂O加入8g氯化鈉，0.2g氯化鉀，1.42g磷酸氫二鈉和0.27g磷酸二氫鉀。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹葉花椒中期染色體的熒光原位雜交方法，其特征在于，所述2×SSC緩沖液的配制方法為：每1000mL的ddH₂O加入8.823g檸檬酸三鈉和17.532g氯化鈉。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹葉花椒中期染色體的熒光原位雜交方法，其特征在于，所述70%FA液由去離子甲酰胺(FA)和2×SSC緩沖液按照體積比7:3組成。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹葉花椒中期染色體的熒光原位雜交方法，其特征在于，所述雜交緩沖液由等體積的1×TE和2×SSC緩沖液組成；其中1×TE的配制方法為：每800mL的ddH₂O中加入1.211g Tris和0.372g EDTANa₂?2H₂O，用HCl調(diào)pH到8.0，定容到1000mL，滅菌后即得。