[發(fā)明專(zhuān)利]褐飛虱激素受體基因NLHR3調(diào)控吡蟲(chóng)啉和毒死蜱協(xié)同增效的基因片段及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710984926.2
• 申請(qǐng)日: 2017-10-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107828791B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐鹿;趙鈞;顧中言;徐德進(jìn);許小龍;徐廣春
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/12
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/12;C07K14/72;C12N15/113;C12N15/10;C12N15/11;A01K67/033
• 代理公司: 南京艾普利德知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32297
• 代理人: 周海斌

1.調(diào)控吡蟲(chóng)啉和毒死蜱協(xié)同增效的基因片段，其特征是，該基因片段的序列如SEQ IDNO.3所示。

2.權(quán)利要求1所述調(diào)控吡蟲(chóng)啉和毒死蜱協(xié)同增效的基因片段的合成方法，其特征是，包括以下步驟：

第一步、從褐飛虱材料中提取總RNA；所述褐飛虱材料至少包括褐飛虱卵、褐飛虱若蟲(chóng)、褐飛虱成蟲(chóng)之一；

第二步、先以褐飛虱總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；再以PCR合成褐飛虱cDNA模板；

第三步、采用引物dsNLHR3-F和引物dsNLHR3-R、以及褐飛虱cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得dsRNA模板并進(jìn)行純化；其中，所述引物dsNLHR3-F的序列為5′端加有T7啟動(dòng)子序列的SEQID NO.5所示序列，所述引物dsNLHR3-R的序列為5′端加有T7啟動(dòng)子序列的SEQ ID NO.6所示序列，所述T7啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO.7所示；

第四步、采用純化后的dsRNA模板，體外合成dsRNA并保存?zhèn)溆茫凰胐sRNA即為目標(biāo)基因片段。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征是，第一步的具體過(guò)程為：

采用總RNA提取試劑盒從褐飛虱材料中提取褐飛虱總RNA；以瓊脂糖凝膠電泳純化褐飛虱總RNA；以核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)褐飛虱總RNA的濃度以及吸光度值；將褐飛虱總RNA凍存；

第二步的具體過(guò)程為：

以褐飛虱總RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈；然后，采用cDNA第一鏈，于PCR儀中合成褐飛虱cDNA模板，具體合成條件為：37℃15min，85℃5s，12℃保持；所得褐飛虱cDNA模板凍存；

第三步的具體過(guò)程為：

采用引物dsNLHR3-F和引物dsNLHR3-R、以及褐飛虱cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并獲得dsRNA模板，擴(kuò)增時(shí)的PCR反應(yīng)條件為：94℃3min，94℃30s，68℃30s以及72℃1min 10個(gè)循環(huán)，94℃30s以及72℃1min 28個(gè)循環(huán)，72℃10min，12℃保持；電泳純化所得dsRNA模板，并以回收試劑盒進(jìn)行純化后保存；

第四步的具體過(guò)程為：

采用純化后的dsRNA模板，以試劑盒體外合成dsRNA，并以2～5倍反應(yīng)體系的無(wú)核酸酶水溶解所得dsRNA，然后凍存?zhèn)溆茫?/p>

第一步中，凍存褐飛虱總RNA的溫度為-80℃以下；第二步中，凍存褐飛虱cDNA模板的溫度為-20℃±5℃；第三步中，純化后保存dsRNA模板的溫度為0℃-4℃或-20℃±5℃；第四步中，凍存dsRNA的溫度為-80℃以下。

4.權(quán)利要求2所述合成方法中所用的引物，其特征是，包括引物dsNLHR3-F和引物dsNLHR3-R，所述引物dsNLHR3-F的序列為5′端加有T7啟動(dòng)子序列的SEQ ID NO.5所示序列，所述引物dsNLHR3-R的序列為5′端加有T7啟動(dòng)子序列的SEQ ID NO.6所示序列，所述T7啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO.7所示。

5.權(quán)利要求1所述調(diào)控吡蟲(chóng)啉和毒死蜱協(xié)同增效的基因片段的用途，其特征是，該用途為用于調(diào)控吡蟲(chóng)啉-毒死蜱復(fù)配組合物針對(duì)褐飛虱的協(xié)同增效效果。

6.權(quán)利要求1所述調(diào)控吡蟲(chóng)啉和毒死蜱協(xié)同增效的基因片段的用途，其特征是，該用途為降低褐飛虱針對(duì)吡蟲(chóng)啉或毒死蜱的抗藥性。

7.含有權(quán)利要求1所述調(diào)控吡蟲(chóng)啉和毒死蜱協(xié)同增效的基因片段的藥物組合物。