[發(fā)明專利]檢測體外細胞增殖用載體及體外細胞增殖動態(tài)檢測方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710983979.2 | 申請日： | 2017-10-20 |
| 公開（公告）號： | CN107916270B | 公開（公告）日： | 2021-09-28 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 聶勇戰(zhàn);竇建華;唐光波;楊美超;張慧霞 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/65 | 分類號： | C12N15/65;C12N15/867;C12N15/66;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 西安恒泰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 61216 | 代理人： | 史玫 |
| 地址： | 710032 *** | 國省代碼： | 陜西;61 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 檢測 體外 細胞 增殖 載體 動態(tài) 方法 | ||
1.一種動態(tài)檢測體外細胞增殖用載體，其特征在于，所述載體是在PLKO.1-TRC載體基礎(chǔ)上構(gòu)建，構(gòu)建方法包括：
(1)用CMV啟動子替換U6啟動子，同時在CMV啟動子前插入TATA box或CAAT box調(diào)控元件；
(2)在CMV啟動子與shRNA Construct之間，插入綠色熒光蛋白eGFP；同時在eGFP起始密碼子ATG前加入Kozak序列；
(3)在eGFP和shRNA Construct之間插入IRES序列。
2.一種動態(tài)檢測體外細胞增殖用載體的構(gòu)建方法，其特征在于，方法是在PLKO.1-TRC載體基礎(chǔ)上構(gòu)建所述動態(tài)檢測體外細胞增殖用載體，包括：
(1)通過TOPO克隆技術(shù)，用CMV啟動子替換U6啟動子，同時在CMV啟動子前插入TATA box或CAAT box調(diào)控元件；
(2)在CMV啟動子與shRNA Construct之間，插入綠色熒光蛋白eGFP；同時在eGFP起始密碼子ATG前加入Kozak序列；
(3)在eGFP和shRNA Construct之間插入IRES序列。
3.一種體外細胞增殖動態(tài)檢測方法，其特征在于，方法包括：
步驟一，用權(quán)利要求1所述載體、psPAX2載體和PMD2.G載體三載體包裝慢病毒；
步驟二，用步驟一得到的慢病毒轉(zhuǎn)染目標細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選、流式細胞術(shù)分選，得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株；
步驟三，將細胞加入細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，高內(nèi)涵細胞成像系統(tǒng)采集圖像；
步驟四，采用高內(nèi)涵細胞分析系統(tǒng)處理步驟三的數(shù)據(jù)，用細胞面積和熒光強度為指標選擇活細胞,并繪制細胞增殖曲線。
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