[發明專利]一種液質聯用分析內毒素類脂A的方法

有效

• 申請號: 201710982117.8
• 申請日: 2017-10-20
• 公開（公告）號: CN107807185B
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發明（設計）人: 胡銳;楊運煌;蔣濱;劉買利
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢物理與數學研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

本發明公開了一種液質聯用分析內毒素類脂A的方法，包括如下步驟：S1.菌株處理；S2.萃取內毒素類脂A：將冷凍干燥后的細胞進行水解反應，待冷卻后將混合物離心，在清洗后的沉淀物中加入體積比為4:4:1的氯仿、甲醇、醋酸銨混合溶液，離心，收集上清液，用氮氣吹干；S3.HPLC?MS分析：通過增強子離子掃描模式獲得碎片離子光譜以確定類脂A的結構信息。本發明建立了一種HPLC?MS分析內毒素類脂A的方法，通過在線分離以及鑒定來確定類脂A的結構信息；采用1%醋酸進行水解，水解程度徹底；并且，通過加入1M濃度的醋酸銨提高類脂A的萃取效果。本發明方法可以檢測出MALDI?TOF未能檢測出的分子量為2002.2和2126.4的類脂A的結構，可以廣泛適用于不同的革蘭氏陰性菌的類脂A分析。

技術領域

本發明屬于分析化學質譜鑒定技術領域，更具體地涉及一種高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）分析內毒素類脂A的方法。

背景技術

空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni，C. jejuni）是一種全球范圍內人獸共患性、感染性腹瀉的主要病原菌，是一種典型的革蘭氏陰性菌，其感染率在世界各地普遍呈上升的趨勢，世界衛生組織（WHO）早在1980年就將空腸彎曲菌引發的病例列為常見的食源性疾病。在歐美等發達國家如美國和新西蘭，由C. jejuni引發的食源性細菌感染在一定程度上已經超過了沙門氏菌和志賀氏菌。家禽類動物是C. jejuni的主要寄主，未經加工的奶制品和未處理的水源也是該菌的主要載體。急性腸胃炎是C. jejuni感染的典型癥狀，免疫力低下者會進一步誘發心內膜炎、關節炎、骨髓炎、腦炎等全身性并發癥，最嚴重的并發癥是某些血清型C. jejuni感染引起周圍神經系統自身免疫性疾病-格林巴利綜合征（Guillain-Barre Syndrome, GBS），又稱感染性脫髓鞘性多發性神經病。

細胞膜脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）包含親水性碳水化合物和疏水性的內毒素，空腸彎曲菌的LPS 因為O-抗原的缺失而被稱為脂寡糖（Lipooligosaccharide ,LOS）。LOS是C. jejuni細胞膜的主要組成部分，它包含疏水性部分的內毒素類脂A和親水性部分的低聚糖。由于其獨特的類似人類神經節苷脂結構和潛在的參與誘導自身免疫性神經疾病如格林巴利綜合征（GBS）和米勒費希爾綜合征（MFS），C. jejuni的LOS結構描述備受研究者的關注。C. jejuni的細胞表面呈現多種結構，包括一些在空腸彎曲菌生物學中起重要作用的多糖，特別是和宿主細菌的相互作用。莢膜，一種高度變異的多糖，在細菌毒性、粘附和入侵上皮細胞中起到重要作用。LOS也是高度變異的，同樣影響細菌在上皮細胞上的粘附和入侵，同時它還在血清抗性中起到重要作用。C. jejuni的LOS結構可以顯示二乙基溴乙酰胺神經節糖苷的分子擬態，這和GBS和MFS是密切相關的。鞭毛在C. jejuni定殖、細胞毒性和上皮細胞的侵入中是必須的，并且可以分泌侵襲抗原。鞭毛蛋白被O-連接的糖基化修飾，這種修飾作用是鞭毛組件必須的，在其活力、毒性、上皮細胞的粘附和入侵中非常重要。而N-連接的糖基化則修飾細胞質和外膜蛋白，N-連接的糖基化作用同樣在細菌定殖、上皮細胞粘附和入侵中非常重要，但是這些聚糖在以上過程中的具體作用尚不明確。