[發(fā)明專利]一種生物發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的工藝

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710981389.6
• 申請(qǐng)日: 2017-10-20
• 公開（公告）號(hào): CN107604009A
• 公開（公告）日: 2018-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋宏婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 宋宏婷
• 主分類號(hào): C12P5/02
• 分類號(hào): C12P5/02;C12R1/645
• 代理公司: 成都九鼎天元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司51214
• 代理人: 錢成岑

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，尤其是一種生物發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的工藝。

背景技術(shù)

番茄紅素是一種類胡蘿卜素，具有提高人體免疫力、抗癌、抗氧化、降血脂、保護(hù)皮膚等功效，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域。天然的番茄紅素，主要存在于茄科植物西紅柿的成熟果實(shí)中。隨著人們?cè)絹碓阶⒅鼐G色、健康，番茄紅素不斷受到人們的廣泛關(guān)注。人類自身不能合成番茄紅素，需通過膳食等方式補(bǔ)充。據(jù)美國CMR（客戶管理關(guān)系）國際公司預(yù)測(cè)，番茄紅素產(chǎn)品銷售將年增35%，預(yù)計(jì)兩三年內(nèi)到達(dá)200億美元的銷售量，世界跨國醫(yī)藥巨頭和國內(nèi)的醫(yī)藥巨頭們紛紛進(jìn)軍番茄紅素產(chǎn)業(yè)。

目前，番茄紅素的生產(chǎn)方法主要有天然提取、化學(xué)合成、微生物發(fā)酵。已證實(shí)，天然番茄紅素比化學(xué)合成的番茄紅素更易吸收，而且，化學(xué)合成化學(xué)物殘留的存在，因此，近年來已轉(zhuǎn)向天然產(chǎn)品的開發(fā)。從植物原料中提取天然番茄紅素易受到條件和產(chǎn)率限制，而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然番茄紅素從品質(zhì)、技術(shù)、資源、成本及環(huán)境等因素考慮均優(yōu)于上述兩種方法，因而更具應(yīng)用前景。目前利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的不足之處在于微生物不能高水平的積累番茄紅素，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本較高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的發(fā)明目的在于：針對(duì)上述存在的問題，提供一種番茄紅素的發(fā)酵生產(chǎn)方法，該方法通過改進(jìn)微生物的種子制備條件，使用于發(fā)酵的微生物具有更高的表達(dá)活性；同時(shí)改進(jìn)發(fā)酵培養(yǎng)條件，以增強(qiáng)累積番茄紅素的代謝流，從而提高番茄紅素的產(chǎn)量。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種生物發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的工藝，其包括：

步驟一：種子制備，分別將正菌孢子和負(fù)菌孢子接入經(jīng)滅菌的生理鹽水中，攪拌得到正菌孢子懸液和負(fù)菌孢子懸液；

步驟二：種子培養(yǎng)，按照正菌孢子懸液與負(fù)菌孢子懸液按照濃度比為2：3-5接入種子培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)得到種子液；

步驟三：發(fā)酵培養(yǎng)，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行12h后，向發(fā)酵液中補(bǔ)充發(fā)酵與原始培養(yǎng)基等量的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基。

本發(fā)明中采用的菌種為三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）的（+）（-）菌株，原始菌種購自于ATCC，編號(hào)分別為ATCC 14271（+），ATCC 14272（-）。需要說明的是，本發(fā)明中的方法對(duì)三孢布拉氏霉菌的其他大多數(shù)亞種也適用。本發(fā)明中直接采用未經(jīng)誘變的菌種，原因在于，經(jīng)誘變的菌種穩(wěn)定性不高，不適用于工業(yè)放大生產(chǎn)。

由于采用了上述技術(shù)方案，將正負(fù)孢子懸液直接接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)進(jìn)行接合生殖，產(chǎn)生的菌體為極小的菌球或菌絲，不發(fā)生成團(tuán)菌體，有利于其在液體培養(yǎng)基中氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。負(fù)菌是番茄紅素的主要產(chǎn)生菌，正菌作為配對(duì)菌與負(fù)菌共同發(fā)酵產(chǎn)生三孢酸，從而促進(jìn)番茄紅素的合成。由于三孢布拉氏霉菌在發(fā)酵過程中需要進(jìn)行接合生殖才能表達(dá)產(chǎn)物，為提高番茄紅素的產(chǎn)量，正菌與負(fù)菌之間需要滿足一定的比例，適當(dāng)提高負(fù)菌的比例，有利于番茄紅素累積，但是其比例過高，三孢酸生成量太少，影響產(chǎn)物合成。

發(fā)酵過程中，營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗并伴隨發(fā)酵液粘度增大，及時(shí)補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)有利于菌體的生殖以及產(chǎn)物表達(dá)，同時(shí)降低發(fā)酵液粘度。

本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，所述新鮮培養(yǎng)基的加入方式為：分別在發(fā)酵的第12h、16h、20h、24h按照1：2 ：4：8的體積比分次加入。

由于采取了上述技術(shù)方案，新鮮培養(yǎng)基以類指數(shù)的方式加入發(fā)酵液，復(fù)合菌體的生長(zhǎng)規(guī)律，更加有利于菌體的生長(zhǎng)。

本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，所述正菌孢子和負(fù)菌孢子均經(jīng)過如下培養(yǎng)得到：將菌種畫線接入含土豆培養(yǎng)基的平皿，在無菌培養(yǎng)箱中，保持溫度26-30℃，培養(yǎng)2-4d；隨后降低溫度至16-20℃，刺激孢子生成，并培養(yǎng)孢子1-3d。

由于采用了上述技術(shù)方案，26-30℃為菌種生長(zhǎng)的最適溫度，在此溫度下生長(zhǎng)2-4d，菌種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)培養(yǎng)溫度的降低，有利于刺激孢子的生成。

本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，培養(yǎng)孢子過程中，以2L/min的速率向培養(yǎng)箱中通入氧氣，同時(shí)給與光照，光照強(qiáng)度為4WLx。

由于采用了上述技術(shù)方案，增加環(huán)境的改變，進(jìn)一步刺激孢子的生成，另一方面，三孢布拉氏霉菌孢子嗜氧，喜光，有利于孢子生長(zhǎng)。

本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，種子培養(yǎng)過程的溫度為26-30℃，培養(yǎng)時(shí)間為1-3d，培養(yǎng)過程攪拌速率為200r/min，給同時(shí)予1vvm的通氣率，以及4WLx光照強(qiáng)度。

由于采用了上述技術(shù)方案，正負(fù)孢子迅速接合生殖，產(chǎn)生球狀或絲狀菌體，并不發(fā)生成團(tuán)現(xiàn)象。