[發明專利]可共價結合底物的標簽蛋白在CLIP中的應用

有效

• 申請號: 201710979254.6
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN107828876B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 俞洋;顧嘉琦
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/68;G01N33/68;G01N33/53
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;張立娜

本發明公開了一種可共價結合底物的標簽蛋白在CLIP中的應用。本發明提供了使用可共價結合底物的標簽融合蛋白通過變性劑純化方式在CLIP技術中的應用。本發明使用可共價結合底物的標簽的融合蛋白通過蛋白變性試劑洗滌的方式得到可以用于測序的RNA文庫，結果證明可以很好地重復以前的文獻發表的實驗結果。在操作上省略了傳統CLIP步驟中需要通過轉膜并且切膠回收片段的步驟。該方法通過可共價結合底物的標可和固定于介質上的特異性結合物形成共價鍵的特性，將傳統上不能在磁珠上直接進行的劇烈洗滌方法加入到實驗操作步驟中。這樣在操作上比較簡便，節省了操作時間，優化了CLIP步驟，減少了操作過程中可能會造成的損失。

技術領域

本發明屬于RNA生物學以及分子生物學領域，涉及一種可共價結合底物的標簽蛋白在進行CLIP(cross-linking immunoprecipitation，紫外交聯免疫共沉淀)實驗中的應用，具體涉及CLIP技術中，使用帶有可共價結合底物的標簽的融合蛋白，通過變性試劑洗滌的方式純化蛋白-RNA共價交聯復合物，從而省略了SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺)電泳、醋酸纖維素轉膜或同位素標記等步驟，最終得到可以用于測序的cDNA文庫。

背景技術

研究RNA結合蛋白和其結合的RNA的分子生物學方法，簡而言之，就是通過純化RNA和RNA結合蛋白的復合物。純化復合物的方法既可以是沉淀RNA，也可以是沉淀RNA結合蛋白。由于沉淀RNA的技術有其局限性，因此科研人員更多的通過沉淀RNA結合蛋白的方法，獲得RNA和RNA結合蛋白質的復合物。最初，RNA結合蛋白免疫共沉淀(RIP)技術被科研人員廣泛運用到研究RNA和蛋白質的互作領域。

RIP技術首先通過針對靶蛋白的抗體把組織或細胞內的相應的RNA和RNA結合蛋白的復合物沉淀下來。然后經過純化和分離得到RNA，并通過下游的分析技術得到RNA的信息。RIP技術與ChIP技術的總體思路類似，但是由于研究的對象不同。其相關的步驟有很多變化。而且RNA在體外容易降解，所以對于RNA的操作和實驗使用的試劑有更高的要求。RIP技術與microarray技術相結合，就成了RIP-Chip技術；與高通量測序技術相結合就成了RIP-seq技術。RIP技術由于對蛋白和核酸復合物的洗滌比較溫和，所以有一定的局限性。在RIP的數據中假陽性的結果比較多，而且也無法得知RNA和蛋白的具體結合位點信息【參見Jayaseelan,S.,F.Doyle,and S.A.Tenenbaum,Profiling post-transcriptionallynetworked mRNA subsets using RIP-Chip and RIP-Seq.Methods,2014.67(1):p.13-9.】。