[發(fā)明專利]一種原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥狀態(tài)的小鼠模型構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710978858.9
• 申請(qǐng)日: 2017-10-19
• 公開（公告）號(hào): CN107854497A
• 公開（公告）日: 2018-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉建民;何泱;王計(jì)秋;孫立昊;趙紅燕;陶蓓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市內(nèi)分泌代謝病研究所;上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院
• 主分類號(hào): A61K35/761
• 分類號(hào): A61K35/761;A01K67/027
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司31227
• 代理人: 曹莉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種模擬原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥病理生理狀態(tài)的小鼠模型的建立方法。

背景技術(shù)

甲狀旁腺激素(Parathyroid Hormone,PTH)是甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的肽類激素，主要作用于成骨細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞，調(diào)控機(jī)體的鈣磷代謝平衡。病理情況下，甲狀旁腺腫瘤或增生分泌過多的PTH入血，引起以高PTH血癥、高鈣血癥為特征的原發(fā)性甲狀旁腺甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥(PHPT)。PHPT是第三大常見的內(nèi)分泌疾病，據(jù)報(bào)道其患病率在1‰-4‰，因其嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松、腎結(jié)石、高鈣危象、急性胰腺炎等并發(fā)癥，嚴(yán)重危害患者的生活質(zhì)量甚至生存率。

除了骨和腎臟等PTH作用的經(jīng)典靶器官，近年來的研究觀察到PHPT患者還出現(xiàn)了神經(jīng)認(rèn)知功能、心血管系統(tǒng)、糖代謝等多個(gè)PTH非經(jīng)典靶器官系統(tǒng)功能的受損，然而這些器官系統(tǒng)受損的原因尚不明確，這些損害的發(fā)生與高PTH血癥和高鈣血癥的關(guān)系尚不清楚，為了更進(jìn)一步明確PHPT的病理生理改變及其機(jī)制，亟需建立以高PTH血癥、高鈣血癥為特征的模擬PHPT病理生理狀態(tài)的小鼠模型。

雖然直接給小鼠注射PTH可以引起短暫的高PTH血癥和高鈣血癥，但是外源性合成PTH的半衰期僅有3-4小時(shí)，難以模擬PHPT患者長(zhǎng)時(shí)間的高PTH血癥；持續(xù)性皮下泵入雖然可以維持高PTH血癥，但目前小鼠用泵最長(zhǎng)只可維持30天，皮下埋泵需要對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉、切開皮膚和縫合，對(duì)小鼠傷害大，且注射泵和外源性合成的PTH成本都很高，不便于應(yīng)用。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的建立PHPT動(dòng)物模型的方法主要有兩種：甲狀旁腺組織特異性過表達(dá)cyclin D1癌基因；和甲狀旁腺組織特異性敲除MEN1抑癌基因，這兩種模型都是通過基因打靶技術(shù)改變甲狀旁腺組織基因，誘導(dǎo)甲狀旁腺組織增生或腫瘤，從而分泌大量PTH入血，而構(gòu)建PHPT小鼠模型，但這兩種構(gòu)建方法存在以下一些問題:1)組織特異性的基因打靶技術(shù)需要的技術(shù)要求高，經(jīng)濟(jì)成本高，構(gòu)建周期長(zhǎng)；2)甲狀旁腺組織特異性Cyclin D1基因過表達(dá)的小鼠，要到其出生后6個(gè)月-1年，甚至更晚才開始出現(xiàn)血PTH和血鈣升高，時(shí)間長(zhǎng)，且此時(shí)小鼠已經(jīng)進(jìn)入老年階段，衰老會(huì)影響神經(jīng)、代謝等多系統(tǒng)功能，不利于小鼠精細(xì)表型的觀察和研究；3)基因打靶技術(shù)難以控制血PTH和血鈣升高的程度，難以研究劑量效應(yīng)關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決現(xiàn)有的PHPT動(dòng)物模型技術(shù)要求高、成本高、周期長(zhǎng)、小鼠年齡大、不能控制劑量等問題，提供一種模擬PHPT病理生理狀態(tài)的小鼠模型的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明為模擬原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥病理生理狀態(tài)小鼠模型，其構(gòu)建步驟如下：

(1)選擇8周齡C57BL/6雄性小鼠，觀察飼養(yǎng)一周；

(2)一周后，用體積濃度為75％的酒精進(jìn)行消毒，消毒部位靜脈注射小鼠PTH基因過表達(dá)腺相關(guān)病毒-9；

所述小鼠PTH基因過表達(dá)腺相關(guān)病毒-9的每只小鼠的注射量為2.5-7.5×10⁹V.g，該劑量范圍既可以保證血PTH升高，又不至于造成血鈣過高致小鼠死亡；

所述小鼠PTH基因過表達(dá)腺相關(guān)病毒-9過表達(dá)的基因?yàn)榧谞钆韵偌に兀珿eneID為NM_020623.2，基因編碼序列長(zhǎng)度為347bp；

(3)從靜脈注射起3周后，即得到模擬原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥病理生理狀態(tài)的小鼠模型。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中，消毒部位為鼠尾。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中，注射使用的為無(wú)菌胰島素注射器。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中，所述步驟(2)中，所述小鼠PTH基因過表達(dá)腺相關(guān)病毒-9的每只小鼠的注射量為2.5-7.5×10⁹V.g。

本發(fā)明的有益效果：本方法建立的模擬PHPT病理生理特點(diǎn)的小鼠模型的優(yōu)勢(shì)在于：

本模型完全模擬了PHPT患者血PTH、血鈣持續(xù)性升高的病理生理特點(diǎn)；

模型建立便捷，構(gòu)建周期短，維持時(shí)間長(zhǎng)，只需單次尾靜脈注射病毒20天后即可模擬高PTH、高血鈣、骨質(zhì)疏松的病理生理特點(diǎn)，且可維持3-6個(gè)月，如需延長(zhǎng)觀察時(shí)間，可再次尾靜脈注射病毒；

腺相關(guān)病毒免疫原性低，且病毒單次注射量低，一次病毒包裝(總量在10¹²V.g/ml)可構(gòu)建1000只左右的小鼠模型，模型成本低；

操作簡(jiǎn)單，操作死亡率低，成功率高，動(dòng)物模型穩(wěn)定性好；

可通過病毒注射的滴度控制血PTH和血鈣升高的程度，便于模擬疾病的不同嚴(yán)重狀態(tài)。

附圖說明