[發(fā)明專利]一種測定白術(shù)多糖的單糖組成的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710978815.0
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN107796897A
• 公開（公告）日: 2018-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊鴻;王少杰;鄧樺;張勇軍;巴娟
• 申請（專利權(quán)）人: 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/74
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司44205
• 代理人: 王國標(biāo)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及測定方法領(lǐng)域，特別涉及測定多糖的單糖組成。

背景技術(shù)

中藥多糖具有增強(qiáng)免疫力、抗應(yīng)激、抗病毒等廣泛的生物學(xué)活性，已在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，也是新獸藥研究的熱點。但目前的現(xiàn)狀是獸用中藥多糖的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的不完善(僅檢測總糖含量)，致使一些假、劣的多糖產(chǎn)品屢屢出現(xiàn)，危害養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此開展獸用中藥多糖質(zhì)量控制的研究，是創(chuàng)制新型多糖藥物或飼料添加劑的重要前提。一般來說，多糖所具有的藥理活性往往與其單糖組成是密切相關(guān)的，因此在檢測總糖含量時還需對其單糖組成進(jìn)行定性分析。由于多糖和單糖都不具有紫外吸收，無法直接對其進(jìn)行測定。在用高效液相色譜法分析多糖組成及其含量時，一般采用凝膠色譜柱與示差折光檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器等儀器，這些方法不僅靈敏度低、基線噪音大、柱溫對結(jié)果影響較大、測定過程中易發(fā)生單糖轉(zhuǎn)化并且這些儀器與色譜柱價格高昂。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種測定白術(shù)多糖的單糖組成的方法，其實現(xiàn)了方法簡單且低成本地對白術(shù)多糖的單糖組成進(jìn)行檢測。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種測定白術(shù)多糖的單糖組成的方法，其包括如下步驟：

1)制備白術(shù)多糖水解樣品：取白術(shù)精制多糖與2mol/L的三氟乙酸溶液混合后于95～98℃下水浴處理7～9h，用4mol/L的氫氧化鈉溶液中和至中性，離心去上清液得白術(shù)多糖水解樣品，備用；

2)制備混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品：取D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖、D-核糖、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖和阿拉伯糖共溶于水得混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品，備用；

3)柱前衍生化處理：分別將步驟1)所得白術(shù)多糖水解樣品和步驟2)所得混合單糖水解標(biāo)準(zhǔn)品與0.5mol/L的PMP甲醇溶液及0.3mol/L的NaOH溶液混合，充分振搖，70℃水浴條件下反應(yīng)30min，后冷卻至室溫，加入0.3mol/L的鹽酸進(jìn)行中和，再加入氯仿進(jìn)行萃取，離心，棄去有機(jī)層，重復(fù)萃取2～3次，得上層水液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，分別得白術(shù)多糖衍生化處理溶液和混合單糖衍生化處理溶液，備用；

4)高效液相色譜法分析：通過高效液相色譜法分別對步驟3)所得的白術(shù)多糖衍生化處理溶液和混合單糖衍生化處理溶液的色譜圖進(jìn)行對比及分析，確定白術(shù)多糖的單糖組成及其含量。

作為上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟1)中所述的白術(shù)精制多糖為白術(shù)粗多糖經(jīng)大孔樹脂純化濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥所得。

作為上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述白術(shù)粗多糖為取藥用白術(shù)按料液重量比為1：(10～20)、浸提時間1～2h、浸提溫度75～78℃、提取次數(shù)3～5次，后經(jīng)抽濾、濃縮提取液，無水乙醇沉淀濃縮10～12h，取沉淀物經(jīng)真空干燥所得。

作為上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟4)中高效液相色譜法是將所述白術(shù)多糖衍生化處理溶液和混合單糖衍生化處理溶液分別經(jīng)色譜柱分離，用磷酸鹽緩沖溶液與乙腈溶液按重量份比為85：15的混合液進(jìn)行洗脫，控制柱溫40℃，流速1mL/min，進(jìn)樣量20μL檢測波長254nm。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過建立PMP柱前衍生化-高效液相色譜法對白術(shù)多糖的單糖組分及含量進(jìn)行分析，其靈敏度高、樣品用量少、穩(wěn)定性好，本發(fā)明的方法準(zhǔn)確可靠，能夠很好地分離各單糖組分，實現(xiàn)了操作簡單且較低成本地檢測白術(shù)多糖中的單糖組成。

附圖說明

本發(fā)明中圖1為實施例1中混合單糖衍生化處理溶液的高效液相分析色譜圖；

本發(fā)明中圖2為實施例1中白術(shù)多糖衍生化處理溶液的高效液相分析色譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，以便于所屬技術(shù)領(lǐng)域的人員對本發(fā)明的理解。有必要在此特別指出的是，實施例只是用于對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)熟練人員，根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容對本發(fā)明作出的非本質(zhì)性的改進(jìn)和調(diào)整，應(yīng)仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。同時下述所提及的原料未詳細(xì)說明的，均為市售產(chǎn)品；未詳細(xì)提及的工藝步驟或制備方法為均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的工藝步驟或制備方法。

實施例1

一種測定白術(shù)多糖的單糖組成的方法，其包括如下步驟：

1)制備白術(shù)粗多糖：取藥用白術(shù)按料液重量比為1：16、浸提時間1.5h、浸提溫度78℃、提取次數(shù)3次，后經(jīng)抽濾、濃縮提取液，無水乙醇沉淀濃縮12h，取沉淀物經(jīng)真空干燥，得白術(shù)粗多糖；