[發明專利]一種基于單鏈接頭的下一代測序文庫的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201710978737.4
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN107586835B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 王進科;武劍
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

1.一種基于單鏈接頭的下一代測序文庫的構建方法，其特征在于，包括以下步驟

（1）將雙鏈DNA片段或RNA/DNA雜合體片段變性，使其成為單鏈DNA；

（2）在單鏈DNA的3′ 端連接一種單鏈接頭；

（3）對連接單鏈接頭的單鏈DNA用DNA聚合酶延伸，使其成為雙鏈DNA；

（4）向雙鏈DNA的無單鏈接頭的一端連接T接頭；

（5）通過PCR擴增兩端連接接頭的雙鏈DNA，使其成為下一代測序可測序的DNA文庫；

或者：（a）用Tn5與Tn5接頭組裝成轉座體；

（b）用轉座體處理DNA樣品或者細胞樣品，使DNA片段化，將片段化的雙鏈DNA片段變性，使其成為單鏈DNA；

（c）在單鏈DNA的3′ 端連接一種單鏈接頭；

（d）對連接單鏈接頭的單鏈DNA用DNA聚合酶延伸，使其成為雙鏈DNA；（e）通過PCR擴增兩端連接接頭的雙鏈DNA，使其成為使其成為下一代測

序可測序的DNA文庫；

所述單鏈接頭為一段帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸；該單鏈接頭的粘性末端為3′端突出的數個隨機核苷酸；該單鏈接頭的另一3′端為基團封閉的平末端；所述3′端突出的數個隨機核苷酸，其長度為1~4個核苷酸；所述粘性末端的5′ 端為磷酸基團，所述平末端的5′端為羥基基團；連接單鏈接頭的粘性末端與步驟（1）或者（b）產生的單鏈DNA的3′端退火，再由核酸連接酶催化單鏈接頭的粘性末端的5′ 端磷酸基團與步驟（1）或者（b）產生的單鏈DNA的3′端羥基基團形成3′-5′磷酸二酯鍵；所述單鏈接頭為單鏈標簽接頭，即在單鏈接頭的雙鏈區中加入標簽序列，且標簽序列靠近3′ 端突出的隨機核苷酸。

2.根據權利要求1所述的下一代測序文庫的構建方法，其特征在于，步驟（1）所述雙鏈DNA片段包括超聲波剪切的DNA片段、各種酶切產生的DNA片段、基于轉座體片段化產生的DNA片段或自然降解的DNA片段。

3.根據權利要求1所述的下一代測序文庫的構建方法，其特征在于，所述Tn5標簽接頭，其序列結構為：5′-引物退火位點序列-標簽序列-ME序列-3′；所述ME序列為雙鏈，引物退火位點序列及標簽序列可為單鏈或雙鏈；雙鏈ME序列的3′ 端為羥基、5′ 端為磷酸基；其中ME序列的一條鏈為5′-AGATGTGTATAAGAGACAG-3′，另一條互補鏈為5′-P-CTGTCTCTTATACACATCT-3′，其中P表示磷酸基。

4.根據權利要求1所述的下一代測序文庫的構建方法，其特征在于，步驟（1）所述RNA/DNA雜合體為用反轉錄反應產生的RNA/DNA雜合體；其變性產生的單鏈DNA為互補DNA。

5.根據權利要求1所述的構建下一代測序文庫的方法，其特征在于，步驟（3）所述DNA聚合酶包括各種DNA聚合酶；所述DNA聚合酶若為普通Taq DNA聚合酶，則步驟（3）延伸產生的雙鏈DNA 的3′端末端自然產生一個突出的A堿基，則DNA聚合酶延伸產物可直接用于步驟（4）連接T接頭；所述DNA聚合酶若為其他高保真DNA聚合酶，則步驟（3）延伸產生的雙鏈DNA的 3′ 端末端不產生一個突出的A堿基，則延伸產物需再用普通Taq DNA聚合酶及其他具有類似功能的酶處理，使延伸產物的3′ 端末端產生一個突出的A堿基，再用于步驟（4）連接T接頭。

6.根據權利要求1所述的構建下一代測序文庫的方法，其特征在于，步驟（4）所述T接頭為一段帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸；該T接頭的粘性末端為3′ 端突出一個T堿基；所述T堿基可與步驟（3）產生的雙鏈DNA 的3′ 端突出的A堿基退火。

7.根據權利要求6所述的構建下一代測序文庫的方法，其特征在于，步驟（4）所述連接為由T接頭的3′ 端突出T堿基與步驟（3）延伸產生的雙鏈DNA的3′ 端突出A堿基退火，再由核酸連接酶催化T接頭與步驟（3）延伸產生的雙鏈DNA間形成3′-5′ 磷酸二酯鍵。