[發明專利]一種富硒酵母培養工藝的優化方法及工藝

有效

• 申請號: 201710977590.7
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN107699505B
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 劉韞滔;唐婷婷;曾思琪;張蘭;柯玉;李誠;胡濱;劉愛平;吳賀君
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N1/18
• 分類號: C12N1/18;C12N1/38;C12R1/865
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

1.一種富硒酵母培養工藝的優化方法，其特征在于，其包括以下步驟：

（1）選取釀酒酵母；

（2）培養基的培養：培養基組分包括葡萄糖、蛋白胨和酵母膏，對這三個成分因素進行正交實驗，得出發酵培養基的最佳配方，其中，正交實驗時，裝液量為50 mL/ 250 mL，接種量為5 %，溫度為30 ℃，pH 為自然，轉速為200 rpm，發酵48 h后測定其菌泥生物量；

（3）培養條件的優化：采用正交實驗，優化轉速、溫度、初始 pH 這三個變量，其中，裝液量為 50 mL/ 250 mL，接種量為 5 %，發酵48 h后測定其菌泥生物量；

（4）富硒條件的優化：正交實驗結果，確定了釀酒酵母的最適的培養條件，選擇不同添加時間、添加方式來添加亞硒酸鈉，進行優化，達到硒的最大化利用；

（5）生產效率測定：采用干重法，將菌泥發酵液 5000 rpm 離心 5 min，棄去上清液并收集菌泥，之后將培養的菌泥冷凍干燥機中凍干，其中，生產效率 g/L= 富硒產品干重 g÷ 液體培養基的體積 L；

（6）硒的測定：利用 3,3-二氨基聯苯胺比色法對硒的含量進行測定；

（7）總硒含量的測定：

酵母菌泥中硒含量測定：準確稱取 1 g 富硒產物，放入燒瓶中，加入 10 mL 消化液，4℃消化至無色透明為止，待冷卻后，將此消化液轉入 50 mL 容量瓶中，用NaOH 調節 pH到 7.0 左右，最后將溶液定容到 50 mL，最后取 10 mL 消化樣液，按 DAB比色法計算硒含量；

（8）有機硒含量；

準確稱取酵母富硒產物 0.5 g，放入透析袋中，充分透析 24 h 后去除無機硒，取透析袋中物質，按上述方法進行硒含量測定；

（9） 綜合考慮富硒量和有機硒轉化率，以確定最優的培養基硒濃度；

富硒量 μg/g = 總硒含量 μg ÷ 菌泥干重 g；

有機硒轉化率 % = 有機硒含量 μg ÷ 總硒含量 μg × 100%；

（10）氨基酸的測定：

氨基酸的測定是利用反相高效液相色譜HPLC完成，該測定配備了Hypersil ODS C18色譜柱，色譜柱為4 mm×125 mm，以 1 mL/min 的流速進行梯度洗脫，柱溫為 40℃，移動相的配置為：緩沖液 A： 0.8 g 醋酸鈉溶于 500 mL 超純水，加入 90μL 三乙胺和 2.9 mL四氫呋喃，最后用醋酸將 pH 值調整為 7.2±0.05；緩沖液 B： 0.8 g 醋酸鈉溶于 100 mL超純水，加入 200 mL 甲醇，最后用醋酸將 pH 值調整為 7.2±0.05；洗脫程序設置為：緩沖液 A/ 緩沖液 B分別為 100:0， 50:50， 0:100， 0:100， 100:0 和 100:0，對應的時間分別是 0， 17， 20， 20.1， 24 和 24.1 min；鄰苯二甲醛作為衍生試劑，檢測波長設置為338 nm，262 nm 用于檢測脯氨酸；標準氨基酸均用 0.1 M HCl 配置成濃度為 1 mM 的儲液，樣品中各氨基酸的含量，通過標準品繪制的標準曲線計算得來，所有樣品分析三次，取平均值；

（11）數據處理與分析：

試驗數據進行單因子方差分析，多重比較，結果以平均數士標準差表示；

所述步驟（4）中，向培養基中加入2 mg/L絲氨酸，以獲得亞硒酸鈉的最大轉化率；

所述步驟（4）中，富硒條件的優化的具體步驟如下：

①硒含量的優化：

分別選取0，20，40，60，80，100 μg/mL的七個設計點，培養48 h 后測定菌體含量，單位硒含量以及有機硒轉化率；

②按不同添加時間添加：將60μg/mL亞硒酸鈉濃度分別在發酵0，12，24，36 h時加入培養基；

③按不同的添加方式添加：

組Ⅰ：在發酵開始就將亞硒酸鈉加入培養基；

組Ⅱ：將60μg/mL亞硒酸鈉含量等分為兩份，分別在發酵開始和12h后加入；

組Ⅲ：將60μg/mL亞硒酸鈉含量等分為三份，分別在發酵開始，12h和24h后加入；

④4.4絲氨酸添加方式的優化：

組Ⅳ：在發酵開始時就將向其中加入2mg/L絲氨酸；

組Ⅴ：將絲氨酸含量等分為兩份，分別在發酵開始和12h后加入；

組Ⅵ：將絲氨酸含量等分為三份，分別在發酵開始，12h和24h后加入。