[發(fā)明專利]一種快速分析開(kāi)環(huán)和超螺旋質(zhì)粒的檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710975456.3
• 申請(qǐng)日: 2017-10-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107782823A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘謳東;韋厚良;陳國(guó)澤;由慶睿;賈國(guó)棟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 和元生物技術(shù)（上海）股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/02
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/02;G01N30/74
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種快速分析菌體裂解液中開(kāi)環(huán)質(zhì)粒和超螺旋質(zhì)粒比例的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

超螺旋質(zhì)粒在DNA疫苗、基因治療和細(xì)胞治療有著廣泛應(yīng)用。隨著基因治療和細(xì)胞治療獲得越來(lái)越多的關(guān)注和研究，對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行分析定量、檢測(cè)其中超螺旋DNA含量在其工業(yè)化生產(chǎn)中顯得至關(guān)重要。傳統(tǒng)的分析超螺旋質(zhì)粒含量的方法有定性的瓊脂糖凝膠電泳、定量的毛細(xì)管電泳和高效液相色譜法。瓊脂糖凝膠電泳是分子生物學(xué)中最基本的一項(xiàng)技術(shù)，雖然操作簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備要求低，但是分辨率不高，只能定性地檢測(cè)超螺旋的比例。高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法可以更加精準(zhǔn)地定量超螺旋質(zhì)粒和開(kāi)環(huán)質(zhì)粒的含量，但是昂貴的設(shè)備和耗材要求使在工藝研發(fā)初始階段和質(zhì)檢設(shè)備體系不夠完善的情況下，很難開(kāi)展相關(guān)定量分析。

本發(fā)明的目的在于開(kāi)發(fā)一種基于親硫性親和填料的分析開(kāi)環(huán)和超螺旋質(zhì)粒的方法。該分析方法和常規(guī)的層析純化實(shí)驗(yàn)類(lèi)似，無(wú)需專門(mén)的高效液相色譜儀和毛細(xì)管電泳儀，特別適合在質(zhì)檢設(shè)備體系不夠完善、急需相關(guān)數(shù)據(jù)支持的工藝研發(fā)初始階段使用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種快速分析開(kāi)環(huán)質(zhì)粒和超螺旋質(zhì)粒比例的檢測(cè)方法，包括以下幾個(gè)步驟：

步驟A：將待測(cè)質(zhì)粒溶液同飽和硫酸銨溶液混合均勻；

步驟B：通過(guò)親和層析對(duì)樣品進(jìn)行分析。

優(yōu)選地，步驟A中選擇0.22 μm或0.45 μm的濾器進(jìn)行過(guò)濾。

優(yōu)選地，步驟B中的親和填料的配基為親硫性疏水基團(tuán)，例如PlasmidSelect Xtra、MEP HyperCel等。

優(yōu)選地，步驟B所選用的平衡流動(dòng)相為2.1-2.5 M (NH4)2SO4, 10-100 mM Tris-HCl, pH6.0-9.0。

優(yōu)選地，步驟B所選用的洗脫流動(dòng)相為1.0-4.0 M NaCl, 10-100 mM Tris-HCl, pH6.0-9.0。

優(yōu)選地，步驟B中的上樣量為不超過(guò)一個(gè)柱體積。

優(yōu)選地，步驟B的操作過(guò)程為，先用平衡流動(dòng)相沖洗層析柱直至電導(dǎo)和紫外吸收基線穩(wěn)定；然后將步驟A中獲得的樣品流經(jīng)層析柱；再用平衡流動(dòng)相沖洗層析柱直至電導(dǎo)和紫外吸收基線穩(wěn)定；最后用洗脫流動(dòng)相以線性洗脫模式洗脫層析柱，監(jiān)測(cè)紫外吸收值。

優(yōu)選地，步驟B中計(jì)算開(kāi)環(huán)質(zhì)粒和超螺旋質(zhì)粒比例的方法為，對(duì)開(kāi)環(huán)質(zhì)粒和超螺旋質(zhì)粒的260 nm吸收峰進(jìn)行積分，計(jì)算峰面積，峰面積之比即為開(kāi)環(huán)質(zhì)粒和超螺旋的質(zhì)粒比例。

本發(fā)明的分析開(kāi)環(huán)質(zhì)粒和超螺旋質(zhì)粒比例的方法簡(jiǎn)單快速，無(wú)需專門(mén)的高效液相色譜儀，實(shí)驗(yàn)室級(jí)別的制備層析儀也可實(shí)現(xiàn)，如GE Healthcare的AKTA系列層析系統(tǒng)。

附圖說(shuō)明

圖1：4種菌體裂解液中的開(kāi)環(huán)質(zhì)粒和超螺旋質(zhì)粒分析的層析圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的較優(yōu)實(shí)施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明：

步驟A：取1.0 g大腸桿菌濕菌體，加入10 ml重懸液（50 mM Tris， 10 mM EDTA，pH7.5）重懸后，加入10 ml裂解液（0.2 M NaOH，1%SDS），最后加入10 ml 中和液（3 M 醋酸鉀，pH5.5）；10000 rpm離心 10 min后，取1.5 ml裂解液與2.5 ml飽和硫酸銨溶液混合。

步驟B：層析分析（圖1）

1）將步驟A中的混合液用0.22 μm針頭濾器過(guò)濾，推入層析儀的上樣環(huán)；

2）先用25 ml 的平衡緩沖液（2.25 M (NH4)2SO4, 10 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH7.5）平衡5 ml HiTrap PlasmidSelect Xtra層析柱，流速5 ml/min；

3）上樣2 ml，流速2 ml/min；

4）上樣結(jié)束后，用20 ml的平衡緩沖液（2.25 M (NH4)2SO4, 10 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH7.5）沖洗層析柱，流速2 ml/min，洗去沒(méi)有結(jié)合以及結(jié)合較弱的雜質(zhì)；

5）用2 M NaCl, 10 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH7.5溶液作洗脫B相，設(shè)置線性梯度0->40%B， 20 ml，流速2 ml/min，當(dāng)梯度達(dá)到21%B時(shí)的峰為開(kāi)環(huán)質(zhì)粒，達(dá)到27%B時(shí)的峰為超螺旋質(zhì)粒；

6）用超純水再生層析柱；