[發明專利]一種改造蛋白折疊分泌途徑增強葡萄糖氧化酶分泌的方法

有效

• 申請號: 201710975230.3
• 申請日: 2014-10-22
• 公開（公告）號: CN107746816B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 張娟;陳堅;顧磊;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/04;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種改造蛋白折疊分泌途徑增強葡萄糖氧化酶分泌的方法，屬于基因工程技術領域。本發明采用基因重組技術將畢赤酵母中KAR2、CNE1、ERO1、SSA4、SSO2、SEC53、BMH2、HRD1、UBC1、GCN4等基因分別克隆連接到畢赤酵母表達載體pGAPZ等系列衍生質粒連接，并與GOD共表達轉化入Pichia pastoris GS115菌株中，考察其效果，并通過模塊化組合優化，經篩選鑒定得到一株較原有菌株增強分泌表達葡萄糖氧化酶的菌株。該菌株表達的葡萄糖氧化酶在3L發酵罐上酶活1972.9U/mL。這為葡萄糖氧化酶的大規模生產奠定了良好的基礎。

技術領域

本發明涉及一種改造蛋白折疊分泌途徑增強葡萄糖氧化酶分泌的方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

葡萄糖氧化酶是生物領域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks將GOD固定在Clark氧電極表面，將其應用于血糖測定以來，GOD被廣泛應用于食品、飼料、醫藥等許多相關領域。

在食品工業中，由于氧的存在，引起許多不利于產品質量的化學反應，并為許多微生物生長創造了條件。目前，許多國家已將GOD作為工人的安全抗氧劑而廣泛應用于各種食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成過氧化氫、形成葡萄糖酸四個方面。利用其專一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析儀，能快速準確簡易地測定各種食品中的葡萄糖含量，指導生產。

在醫藥工業中，GOD作為試劑盒、酶電極等用于血清(漿)、尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；GOD制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑、牙垢和齲齒的形成防止口腔疾病和牙病的發生。此外，由于可以催化生成H202，還可用于對H2O2敏感的淋巴瘤的導向目標的治療。

GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動物腸道環境，調節飼糧消化，促進動物生長。含葡萄糖氧化酶、乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑，可用于預防牲畜胃腸道感染、腹瀉，并有促進動物生長作用。

從動植物組織中提取GOD有一定的局限，酶量亦不豐富；細菌GOD產酶量少；一般采用黑曲霉(具有GRAS資格)和青霉屬菌株作為GOD生產菌。我國及美國均采用點青霉及產黃青霉生產GOD，日本常用尼崎青霉，俄羅斯用生機青霉，近年報道膠霉屬(Clioctadium)、擬青霉屬(Paecilomyces)和帚霉屬(Scopulariopsis)也能生產GOD。

產量低、酶活低、檢測方法復雜是GOD產業化的限制性因素，國內外為此做了大量工作并取得了明顯進展。目前國外生產的GOD廠家主要是德國的Boehringer和日本的TOYOBO。規模化生產高活性的GOD還有困難。發酵生產GOD的同時產生大量雜蛋白，分離提取復雜，成本高。

利用基因工程或發酵工程來研究GOD的過量表達。其酶學性質、分子改造最終實現葡萄糖氧化酶的工業化生產奠定了一定的理論基礎和策略導向。

發明內容

本發明提供了一種改造蛋白折疊分泌通路增強葡萄糖氧化酶分泌的方法，是在Pichia pastoris GS115中表達葡萄糖氧化酶基因GOD的基礎上，進一步將畢赤酵母中KAR2、CNE1、ERO1、SSA4、SSO2、SEC53、BMH2、HRD1、UBC1、GCN4等基因分別克隆連接到畢赤酵母表達載體pGAPZ等系列衍生質粒進行共表達，或者對上述基因進行模塊化組合表達，獲得葡萄糖氧化酶分泌表達增強的菌株。

所述改造蛋白折疊分泌通路增強葡萄糖氧化酶分泌的方法中，蛋白折疊分泌通路包括三個模塊，其中，模塊一包括囊泡運輸基因SSA4、SSO2、SEC53、BMH2，ERAD基因HRD1、UBC1；模塊二包括內質網中折疊基因KAR2、CNE1、ERO1；模塊三是脅迫應激反應基因GCN4；所述改造，是表達三個模塊中的任意一個基因，或同時表達模塊一中的任意一個基因及模塊二中任意一個基因，或同時表達模塊一至三中的各一個基因。