[發明專利]利用啤酒酵母MF?α介導重組蛋白分泌的植物表達載體

在審

• 申請號: 201710974822.3
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN107653261A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發明（設計）人: 陳麗梅;陳悅;曹文佳;郭紅霞
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;C12N15/31;A01H6/82;A01H6/42
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技術領域

本發明涉及利用啤酒酵母MF-α介導重組蛋白分泌的植物表達載體，通過Gateway技術構建了植物表達載體PK-35S-MF-α-Egfp，使表達的重組蛋白分泌到植物體外，屬于植物分子基因工程領域。

背景技術

引導新合成蛋白質分泌的信號肽(signal peptide)是存在于分泌蛋白質N末端的特異氨基酸序列。Gunter Blobel于20世紀70年代提出信號肽假說，認為蛋白質合成在核糖體上進行，信號肽作為蛋白質的一個片段引導核糖體定位于內質網通道上，并牽引合成的多肽穿過內質網通道，隨后信號肽被肽酶切除，蛋白質被釋放到內質網腔，由轉運小泡轉運到胞外。隨后20年Blobel小組對這一過程做了深入研究,證實了該假說的正確性和普遍性。畢赤酵母外源蛋白分泌機制符合“信號肽假說”理論，根據蛋白合成初期經胞質到內質網腔轉運途徑不同分為“共轉運”和“翻譯后轉運”兩種分泌方式。

酵母特有的分泌信號肽表達外源基因，會得到較好的分泌效果。酵母信號肽主要有來自啤酒酵母的MF-α、酸性磷酸脂酶PHO1信號肽、蔗糖酶基因(sucrase2,SUC2)信號肽、Killer毒素信號肽、間質金屬蛋白酶(MMP)/間質金屬蛋白酶組織抑制劑信號肽、菊粉酶信號肽(INU)等，還有一些新的信號肽不斷被發現和利用。其中MF-α在酵母表達外源蛋白中應用最為廣泛。如Akira Murasugi等用MF-α天然信號肽和PHO1信號肽來引導人重組肝素結合細胞因子在畢赤酵母中的分泌發現，三種信號肽均可以引導蛋白的分泌，但是以MF-α的分泌效率最高，可能與MF-α前導序列引導蛋白至高爾基體或小囊泡的效率有關，也可能與蛋白質折疊和二硫鍵形成有關。

綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)是由日本學者下村修于1962年從多管水母(Aequorea victoria)中發現并分離得到的一種發光蛋白。分子質量為26ku,是由238個氨基酸構成的/B-桶0型三維立體結構,其中第65-67位氨基酸(絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸)形成發光團,為主要發光的位置。GFP的結構賦予了其一些獨特的性質:熒光穩定、檢測方便、無種屬特異性、不需任何反應底物和輔助因子、易于構建載體,并且它不會破壞細胞生長環境,對細胞生理功能無影響等,因此是常用的報告基因。目前,科研人員根據不同需要,利用氨基酸序列修飾等方法對GFP進行改進,獲得了一系列優良的變異體,發光的強度和顏色都有變化,如苯丙氨酸64被亮氨酸取代,絲氨酸65被蘇氨酸取代的EGFP熒光強度就增加了35倍；而且出現了紅色、黃綠色、藍色等多種顏色的熒光蛋白,大大拓寬了GFP研究的領域。

金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)是一類缺乏芳香族氨基酸、富含半胱氨酸，可以通過SH－基團與眾多金屬離子結合的小分子蛋白質。MT蛋白具有廣泛性、結構多態性、表達誘導性和進化保守性等特點，在生物體內發揮著重要的生物學功能。人MT基因具有多個亞型，包括10個功能性基因和7個非功能性基因的異構體。MT-3，又稱神經生長抑制因子，專一性表達于中樞神經系統中，具有與其他MT亞型一致的重金屬解毒和清除自由基等功能。

許多研究都表明一些蛋白質利用自身信號肽雖然可引導蛋白質在酵母中的高效表達，然而大部分蛋白質利用自身信號肽引導蛋白在酵母系統中的分泌效率很低，如脂肪酶等。往往會出現目的蛋白胞內堆積不能有效分泌表達的現象，且表達的重組蛋白較易降解。因此常優先選用酵母特有的分泌信號肽表達外源基因，會得到較好的分泌效果。但是目前還沒有研究報道酵母分泌型的信號肽在植物體中是否可以介導外源重組蛋白分泌到植物體外。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用啤酒酵母MF-α介導重組蛋白分泌的植物表達載體PK-35S-MF-α-外源基因，該載體中的MF-α-外源基因在35S組成型啟動子的控制下表達，通過農桿菌介導的葉盤轉化法將該植物表達載體轉入野生型煙草，通過葉柄轉化法把該植物表達載體轉入野生型天竺葵后，外源基因在35S組成型啟動子的控制下能夠高效表達外源基因編碼的蛋白，然后分泌到植物體外。

所述啤酒酵母MF-α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。