[發(fā)明專利]一種端粒探針及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710974752.1
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN107723342B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宗慎飛;王樂;陳晨;王著元;崔一平
• 申請（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

本發(fā)明公開了一種端粒探針及其制備方法和應(yīng)用，該端粒探針為在CdSSe/ZnS量子點表面偶聯(lián)了單鏈DNA，該端粒探針可以通過原位雜交技術(shù)結(jié)合到細(xì)胞端粒，用單分子定位技術(shù)對雜交了端粒探針的端粒進(jìn)行成像，實現(xiàn)對端粒的檢測。本發(fā)明實現(xiàn)了端粒的特異性標(biāo)記，利用單分子定位顯微鏡成像，分辨率更高，克服了熒光顯微技術(shù)的受光學(xué)衍射極限限制的缺點，利用本發(fā)明可以實現(xiàn)對端粒結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及DNA探針及其制備方法和應(yīng)用，特別涉及一種端粒探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

端粒是真核生物染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，其序列中是富含G核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。染色體DNA末端膨大成粒狀，像帽子那樣蓋在每條染色單體的兩端，因此，每對染色體有2個染色單體和4個端粒。該結(jié)構(gòu)和染色體斷裂形成的末端存在許多差異，如不能相互融合，而且只有當(dāng)染色體末端結(jié)構(gòu)完整時，細(xì)胞才能復(fù)制。在脊椎動物中端粒序列是由TTAGGG重復(fù)序列及其互補(bǔ)序列構(gòu)成的雙鏈結(jié)構(gòu)，并且其中一條單鏈的3’懸突于外，構(gòu)成了一種由數(shù)百個堿基組成的懸突結(jié)構(gòu)。這個懸突結(jié)構(gòu)再通過折疊作用與雙鏈形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)(T環(huán)，t-loop)，對染色體末端起到保護(hù)作用。在DNA復(fù)制過程中，染色體末端有一端遺傳信息得不到復(fù)制，所以在普通人體細(xì)胞中，端粒的末端會隨周期性復(fù)制而逐漸縮短，這就限制了細(xì)胞的增殖能力，當(dāng)至某一特定界限時，細(xì)胞將停止分裂而凋亡。端粒不僅被認(rèn)為是與細(xì)胞衰老有關(guān)，而且還與許多疾病有關(guān)。所以端粒的研究在癌癥治療領(lǐng)域意義重大。

目前已存在了一些研究端粒的常用方法：DNA印跡法、雜交保護(hù)分析法(HPA)、定量PCR法(PCR)、單個端粒長度分析法(STELA)，但這些方法都存在著各種問題，例如不能在細(xì)胞水平給出詳細(xì)的端粒信息，不均勻的引物退火可能導(dǎo)致端粒長度測量不充分以及引物自身之間可能發(fā)生雜交等問題。而熒光原位雜交技術(shù)(FISH)利用端粒特異性，直接將探針標(biāo)記在端粒序列上，結(jié)合熒光顯微鏡技術(shù)，不僅操作簡單，而且尺寸小的端粒探針增加了進(jìn)入細(xì)胞的滲入度。通常，F(xiàn)ISH技術(shù)使用的熒光顯微技術(shù)，其成像分辨率受光學(xué)衍射極限限制，一般只能達(dá)到200-300nm。這一分辨率使得人們無法對端粒進(jìn)行細(xì)致地觀察。

光學(xué)超分辨成像突破了衍射極限限制，達(dá)到更高的空間分辨率。現(xiàn)在用于超分辨成像的技術(shù)主要包括3類：基于光調(diào)制的受激發(fā)射損耗(STED)技術(shù)和結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(SIM)技術(shù)以及基于單分子定位的光激活定位顯微鏡(SMLM)和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(STORM)。相比于STED和SIM技術(shù)，單分子定位顯微鏡(SMLM)的成像分辨率更高，這使得單分子定位技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛運用。因此，利用單分子定位技術(shù)進(jìn)行端粒成像，有望對端粒的結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入地研究。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明為了克服端粒檢測中遇到的檢測步驟復(fù)雜且檢測不準(zhǔn)確的問題，提供了這一種端粒探針，實現(xiàn)端粒的精準(zhǔn)檢測。本發(fā)明還提供了該端粒探針的制備方法及其應(yīng)用。

技術(shù)方案：本發(fā)明所述一種端粒探針，為在CdSSe/ZnS量子點表面偶聯(lián)了單鏈DNA；所述單鏈DNA通過5’端的氨基與CdSSe/ZnS量子點表面的羧基配體偶聯(lián)；所述單鏈DNA序列為3’-AATCCCAATCCCAATCCCTTTTT-(NH₂)₆-5’。

上述的端粒探針的制備方法，包含以下步驟：

(1)油相量子點轉(zhuǎn)相：將油相CdSSe/ZnS量子點溶于三氯甲烷中，加入巰基丙酸，混合均勻后再加入四甲基氫氧化銨調(diào)節(jié)溶液pH值，攪拌反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，向溶液中加入水，攪拌，靜置分層，取上清液；在上清液中加入無水乙醇沉淀，離心，去除上清液，所得沉淀為水相CdSSe/ZnS量子點；將油相CdSSe/ZnS量子點轉(zhuǎn)化為水相CdSSe/ZnS量子點，原因是使CdSSe/ZnS量子點符合單分子定位技術(shù)對熒光探針的要求，即量子點在水溶液或者磷酸鹽緩沖液中具有單波長激發(fā)下的熒光閃爍行為。