[發明專利]一種含有干細胞外泌體的電子煙煙液及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 201710972166.3
• 申請日: 2017-10-18
• 公開（公告）號: CN107510098A
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發明（設計）人: 閆旭;李柱;韓緒春;郭崗;黃國鋒;吳進;許元基
• 申請（專利權）人: 廈門諾康得生物科技有限公司
• 主分類號: A24F47/00
• 分類號: A24F47/00;A24B15/24;C12N5/0775
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙)35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及電子煙，尤其是涉及添加臍帶間充質干細胞外泌體的電子煙在改善肺功能中應用的一種含有干細胞外泌體的電子煙煙液及其制備方法與應用。

背景技術

電子煙，又稱電霧化卷煙，是一種通過電子加熱手段向呼吸系統傳送電子煙煙液的電子裝置。電子煙主要由煙桿(包括發光二極管、電池、控制電路、氣動開關和霧化器等元器件)和煙彈(包括儲液腔和吸嘴)組成。在抽吸電子煙時，氣動感應開關在抽吸的負壓作用下觸發，通過電磁感應作用使集成控制電路接通，指示燈亮起，在電加熱絲加熱煙彈中煙液的同時霧化器發出超聲波使貯液腔里的煙液霧化，霧化煙液隨著氣流進入人體口腔，從而達到模擬煙液的效果。雖然和卷煙相比，電子煙少了許多有害成分，但煙液的主要成分是尼古丁和丙二醇，丙二醇在短時間內刺激呼吸道，長期、反復吸入丙二醇會對人體產生哪些不良影響尚不清楚，而長期吸入尼古丁會對吸食者肺部造成一定傷害。

干細胞外泌體(exosomes)是干細胞釋放到細胞外基質中的膜分泌體系，不僅含有干細胞的活性物質，而且具有選擇性組裝、靶向性投遞、高效修復受損組織、安全性高、化學性質穩定易于保存等特點，是干細胞領域具有重要研究價值的新興熱點。外泌體作為細胞在特定環境下分泌的膜包裹的遞質，在細胞間信息傳導過程中起到重要作用。干細胞外泌體包含有大量的生物信息傳播介質，如mRNA、miRNA的遺傳信息，核糖核蛋白體等蛋白質、脂質、膜受體以及其他一些具有生物活性的物質。

有研究結果顯示，干細胞外泌體能抑制全身炎癥反應，減少肺組織氧化應激損傷，改善肺毛細血管通透性，減輕肺損傷的嚴重程度。有研究結果顯示，MAPK信號通路在機械通氣肺損傷中活性增加，對機械通氣肺損傷具有保護作用。在實驗中，注射干細胞外泌體的實驗組和模型組大鼠肺組織建模后p-JNK、p-P38、p-ERK蛋白水平較注射生理鹽水的對照組增高，實驗組大鼠肺組織p-JNK、p-P38、p-ERK蛋白水平較模型組降低。因此，MSC外泌體可能通過抑制內毒素誘導急性肺損傷大鼠肺組織中p-JNK、p-P38、p-ERK蛋白表達來發揮對肺組織的保護作用。

發明內容

本發明的目的在于針對目前干細胞外泌體通過注射的方式經過血液循環進入肺部改善肺功能、注射干細胞外泌體的方式門檻高、生物安全性不夠等問題，提供將干細胞外泌體通過電子煙霧化的方式被人體吸收，避免上述各種缺點的一種含有干細胞外泌體的電子煙煙液及其制備方法。

本發明的另一目的在于提供所述含有干細胞外泌體的電子煙煙液的應用。

所述含有干細胞外泌體的電子煙煙液的原料組成按質量百分比為：65％～80％丙二醇、1％～2％香料、15％～20％甘油、5％～15％水，另外包含臍帶間充質干細胞外泌體，所述臍帶間充質干細胞外泌體的含量為1mg/g。

所述含有干細胞外泌體的電子煙煙液的原料組成按質量百分比優選：63％～70％丙二醇、1％～2％香料、15％～20％甘油、5％～15％水，另外包含臍帶間充質干細胞外泌體，所述臍帶間充質干細胞外泌體的含量為1mg/g。

所述水可采用蒸餾水。所述臍帶間充質干細胞外泌體的制備方法可為：將P3代臍帶間充質干細胞種植于T175細胞培養瓶中，當細胞融合后清洗，然后更換無血清培養基繼續培養，收集細胞上清用于外泌體分離制備；然后根據Capturem^TMExosome Isolation Kit(Cell Culture)的使用說明進行外泌體的分離制備；所述當細胞融合后清洗，可當細胞融合達到80％左右后用PBS清洗；所述繼續培養的時間可為48～72h。

所述臍帶間充質干細胞的具體制備方法可為：取新鮮健康臍帶沖洗干凈后，剔去血管，剝出華氏膠組織，將所得華氏膠組織剪碎；在細胞培養皿中加入培養液培養，有部分細胞從華氏膠組織塊周圍爬出，細胞開始增殖，形成細胞集落，待細胞長滿后傳代。

所述沖洗干凈可采用PBS沖洗，所述剔去血管可采用剪刀鑷子剔去血管；所述將所得華氏膠組織剪碎可剪碎至1mm³大小；所述培養液可采用α-MEM培養液，所述培養液中含10％FBS，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素；所述在細胞培養皿中加入培養液培養，最好培養液剛好覆蓋華氏膠組織塊；所述培養的條件可置于37℃，5％的CO₂培養箱培養5～7天；所述有部分細胞從華氏膠組織塊周圍爬出的細胞形態呈細小的梭形；所述細胞開始增殖的條件可為：1周后，細胞開始迅速增殖，形成大小不等的細胞集落，待細胞長滿后，用0.25％胰蛋白酶消化傳代。