[發(fā)明專利]應(yīng)用于肝細(xì)胞癌的一組實(shí)時(shí)定量PCR相對(duì)定量的內(nèi)參基因及其篩選方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710971976.7
• 申請(qǐng)日: 2017-10-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107641652B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鐘凡;劉陽(yáng);徐萍;王靜;賴躍興;楊志文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市松江區(qū)中心醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11;C12N15/10;G16B20/20
• 代理公司: 上海精晟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.應(yīng)用于肝細(xì)胞癌的一組實(shí)時(shí)定量PCR相對(duì)定量的內(nèi)參基因，其特征在于：所述的內(nèi)參基因?yàn)門FG和SFRS4，所述內(nèi)參基因作用于肝細(xì)胞癌細(xì)胞系。

2.一種權(quán)利要求1所述的內(nèi)參基因的篩選方法，包括如下步驟：

(1)全基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)收集以及候選內(nèi)參基因初步篩選；

(2)選取細(xì)胞株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，提取細(xì)胞株總RNA并進(jìn)行cDNA合成；

(3)定量PCR引物設(shè)計(jì)及引物擴(kuò)增效率檢驗(yàn)；

(4)定量PCR后對(duì)候選基因表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)估；

所述步驟(1)中采用以細(xì)胞種類為單元進(jìn)行數(shù)據(jù)篩選，基因在10種肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)量均以平行測(cè)量MAS 5.0信號(hào)值的算術(shù)平均為代表；篩選標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)基因在10種肝癌細(xì)胞中表達(dá)量的變異系數(shù)CV＜0.11，且基因具有一定的表達(dá)水平以及控制任意兩種細(xì)胞間表達(dá)量的極差不得過(guò)高M(jìn)FC＝Max(I_i)/Min(I_i)＜1.4，其中I_i表示在每一個(gè)細(xì)胞樣本中基因的表達(dá)；

所述步驟(2)選取細(xì)胞株為肝細(xì)胞癌細(xì)胞株：Huh-7、Hep3B、PLC/PRF/5、MHCC-97L、MHCC-97H、HCCLM3、SNU-398、SNU-449、SNU-475；除Huh-7來(lái)自HCV感染的肝癌病人外，其余細(xì)胞株均來(lái)自于HBV感染的肝癌病人。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的內(nèi)參基因的篩選方法，其特征在于：所述Huh-7、Hep3B、PLC/PRF/5、MHCC-97L、MHCC-97H、HCCLM3在10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代和培養(yǎng)，所述SNU-398、SNU-449、SNU-475在10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代、培養(yǎng)，所述細(xì)胞均在5％二氧化碳培養(yǎng)箱中于37℃孵育培養(yǎng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的內(nèi)參基因的篩選方法，其特征在于：所述步驟(2)中提取細(xì)胞株總RNA并進(jìn)行cDNA合成步驟包括每種細(xì)胞系收集約5×10⁶對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加1毫升Trizol裂解，輕輕吹打均勻，室溫靜置5分鐘，使其充分裂解；4℃12000g離心5分鐘，棄沉淀；按照200微升氯仿/1毫升Trizol加入氯仿，劇烈震蕩30秒后室溫靜置15分鐘待其分層；4℃12000g離心15分鐘；吸取上層水相，至一新管中；按照0.5毫升異丙醇/1毫升Trizol加入異丙醇，混勻后室溫放置5～10分鐘；4℃12000g離心10分鐘，棄上清，可見(jiàn)RNA沉淀于管底；按照1毫升75％乙醇/1毫升Trizol加入75％乙醇，溫和震蕩離心管，懸浮沉淀；4℃7500g離心5分鐘，棄上清，并重復(fù)一次；室溫吹干沉淀，但不要過(guò)分干燥；加適量無(wú)RNA酶雙蒸水，溶解RNA樣品；測(cè)OD比值定量RNA濃度及驗(yàn)證RNA純度；按照一定的體積比配制DNA I反應(yīng)體系溶液，包括2微克總RNA，5×gDNA Eraser緩沖液，gDNA Eraser，無(wú)RNA酶蒸餾水；42℃反應(yīng)2分鐘后4℃保存；得到的反應(yīng)液進(jìn)一步進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，加入PrimeScript RT Enzyme Mix I、RT Primer Mix、5×PrimeScript緩沖液以及無(wú)RNA酶蒸餾水，于37℃反應(yīng)15分鐘、85℃反應(yīng)5秒，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的內(nèi)參基因的篩選方法，其特征在于：所述步驟(3)中定量PCR引物設(shè)計(jì)通過(guò)PerlPrimer v1.1.16、NCBI primer BLAST、文獻(xiàn)和引物庫(kù)進(jìn)行基因引物設(shè)計(jì)，所引物擴(kuò)增效率檢驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢驗(yàn)候選基因擴(kuò)增引物的擴(kuò)增效率，取一定量的模板cDNA，進(jìn)行5個(gè)梯度稀釋后，建立各個(gè)候選基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)斜率通過(guò)公式E＝10^-1/Slope計(jì)算出特定引物的擴(kuò)增效率，選取擴(kuò)增效率1.8～2.1之間的候選基因引物進(jìn)行下一步定量復(fù)驗(yàn)。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的內(nèi)參基因的篩選方法，其特征在于：所述步驟(4)中定量PCR在肝癌細(xì)胞株中開(kāi)展3次生物學(xué)重復(fù)的qRT-PCR復(fù)驗(yàn)，獲取到不同細(xì)胞株中候選基因的C_t值，所述候選基因表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)估采用了四種不同的算法geNorm、NormFinder、DeltaCt和BestKeeper及其穩(wěn)定性指數(shù)整合工具RefFinder對(duì)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行打分，并最終的整合結(jié)果；由于一些算法是全局依賴性的，即某個(gè)基因的穩(wěn)定性得分會(huì)隨著參與計(jì)算的其它基因的不同而改變，我們采用了迭代排除法逐次去掉最不穩(wěn)定的一個(gè)基因，直至候選列表縮減到只剩最后兩個(gè)基因?yàn)橹梗痪唧w操作是：geNorm、NormFinder、DeltaCt和BestKeeper分別會(huì)對(duì)輸入的候選基因有一個(gè)不穩(wěn)定性得分，分?jǐn)?shù)越高則表明該基因的表現(xiàn)越不穩(wěn)定；我們將分?jǐn)?shù)升序排列即可得到該輪評(píng)估中候選內(nèi)參的穩(wěn)定性排序，而RefFinder則將候選基因在四種算法中的排序數(shù)取幾何平均作為其綜合不穩(wěn)定性得分；我們?nèi)サ粼撦喌梅肿罡叩幕颍瑢⑹Ｏ碌幕虬瓷鲜霾襟E重新計(jì)算不穩(wěn)定性得分；如此循環(huán)處理，直至剩下無(wú)法區(qū)分穩(wěn)定性差異的兩個(gè)最穩(wěn)定基因；除了用RefFinder整合法評(píng)估外，也在四種算法中分別單線采用迭代排除法得到評(píng)估結(jié)果以作參考。