[發明專利]利用乙酸生產羥基丙酸的代謝工程大腸桿菌菌株的構建方法與應用有效

申請號：	201710969403.0	申請日：	2017-10-18
公開（公告）號：	CN107881186B	公開（公告）日：	2021-02-02
發明（設計）人：	吳輝;黃兵;李志敏;楊昊;葉勤	申請（專利權）人：	華東理工大學
主分類號：	C12N15/70	分類號：	C12N15/70;C12N1/21;C12P7/42;C12N15/53;C12R1/19
代理公司：	上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 31218	代理人：	翟羽
地址：	200237 ***	國省代碼：	上海;31
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摘要：
搜索關鍵詞：	利用乙酸生產羥基丙酸代謝工程大腸桿菌菌株構建方法應用
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【權利要求書】：

1.一種利用乙酸生產羥基丙酸代謝工程大腸桿菌菌株的構建方法，其特征在于，代謝工程改造的大腸桿菌以乙酸為原料發酵生產羥基丙酸，所述羥基丙酸是指3-羥基丙酸、或乳酸、或3-羥基丙酸和乳酸混合物，其改造途徑為構建乙酰CoA生產羥基丙酸的代謝途徑，并和/或過表達乙酸攝入途徑的相關基因以增強乙酸的運輸速率，并和/或阻斷TCA循環或下調TCA循環以增加流向目標代謝產物的乙酰CoA代謝流，并和/或減少蘋果酸和草酰乙酸的脫羧反應以缺失副產物生成途徑，和/或缺失乙醇生產途徑中關鍵基因以調節乙酰CoA節點代謝流，和/或輔酶工程調節胞內氧化還原平衡；

若目標產物為3-羥基丙酸，過表達來源于谷氨酸棒桿菌的乙酰-CoA羧化酶編碼基因(acc)與來源于綠曲繞絲狀菌(C. aurantiacua)丙二酰-CoA還原酶編碼基因(mcr)，實現3-羥基丙酸合成；通過過表達來源于Candida boidinii菌株的甲酸脫氫酶編碼基因fdh以增加胞內可利用的NADH含量，通過過表達來源于E.coli的轉氫酶編碼基因(pntAB、udhA)和/或NAD激酶編碼基因(nadK)以增加胞內NADH轉變成NADPH的含量，從而為3-羥基丙酸的生產提供所需的輔酶；

若目標代謝產物為乳酸，過表達丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶編碼基因(pfor)，過表達乳酸脫氫酶編碼基因(ldh)，實現乳酸合成，通過過表達來源于Candida boidinii菌株的甲酸脫氫酶編碼基因fdh以增加胞內可利用的NADH含量，從而為乳酸的生產提供所需的輔酶；

若目標代謝產物為3-羥基丙酸和乳酸混合物，過表達來源于Propionibacterium freudenreichii的甲基丙二酰-CoA羧基轉移酶編碼基因(mmc)，與來源于綠曲繞絲狀菌丙二酰-CoA還原酶編碼基因(mcr),過表達乳酸脫氫酶編碼基因(ldh)，實現3-羥基丙酸和乳酸聯產；通過過表達來源于E.coli的NAD激酶(nadK)和/或轉氫酶編碼基因(pntAB、udhA)以增加胞內NADPH含量；通過過表達來源于Candida boidinii菌株的甲酸脫氫酶編碼基因fdh以增加胞內可利用的NADH含量，從而為3-羥基丙酸和乳酸的生產提供所需的輔酶。

2.根據權利要求1所述的一種利用乙酸生產羥基丙酸代謝工程大腸桿菌菌株的構建方法，其特征在于，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶編碼基因來源于Clostridium thermocellum、Clostridium sp.BNL1100、Clostridium clariflavum、Clostridium butyricum、Clostridium pasteurianum BC1、Clostridium baratii str.Sullivan、Alkaliphilus oremlandii或Desulfotalea psychrophila LSv54菌株。