[發明專利]一種煙酰胺的生產工藝

有效

• 申請號: 201710962095.9
• 申請日: 2017-10-16
• 公開（公告）號: CN107916283B
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 楊立榮;周海勝;吳堅平;徐剛
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12P17/12
• 分類號: C12P17/12;C12N15/70;C12N15/60;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

1.一種煙酰胺的生產工藝，包括：重組腈水合酶基因工程菌的構建，所述工程菌的發酵培養以及利用所述工程菌催化3-氰基吡啶得到煙酰胺；其特征在于：

所述重組腈水合酶基因工程菌包括宿主細胞和轉入宿主細胞的目的基因，所述宿主細胞為大腸桿菌，所述目的基因為堿基序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的腈水合酶基因；

所述發酵培養的過程包括：菌種活化、種子培養和補料分批發酵；

所述補料分批發酵的過程包括：

（1）細胞快繁階段：將種子培養后的重組腈水合酶基因工程菌菌種接種至基礎發酵培養基中進行培養；其中，培養的溫度為32~35℃，發酵液的溶氧量為20~30%，發酵液的pH值為6.8~7.2；在培養過程中，通過向發酵液補加補料培養基來控制基因工程菌的比生長速率在0.2~0.5之間；以基礎發酵培養基的體積計，所述基因工程菌菌種的接種量為5~15%；發酵培養的時間為8~16 h；

（2）產酶階段：待發酵液中基因工程菌的細胞濃度達到OD₆₀₀=70~90時，向發酵液中加入乳糖誘導基因工程菌產酶，直至發酵結束；其中，培養的溫度為18~20℃，發酵液的溶氧量為30~50%，發酵液的pH值為6.8~7.2；在培養過程中，通過向發酵液補加補料培養基來控制基因工程菌的比生長速率在0.01~0.1之間；以發酵液的體積計，所述乳糖的投加量為5~15g/L；發酵培養的時間為48~96 h；

所述基礎發酵培養基為：20 g/L甘油，8 g/L蛋白胨，12 g/L酵母抽提物，17.1 g/LNa₂HPO₄·12 H₂O，3.0 g/L KH₂PO₄，0.5 g/L NaCl，1.0 g/L NH₄Cl和0.6 g/L MgSO₄，卡那霉素濃度為50 μg/mL；

所述補料培養基為：300~600g/L甘油，20g/L蛋白胨，10 g/L酵母抽提物；

所述催化的過程包括：（A）以水為溶劑，重懸所述工程菌，制得細胞懸液；（B）向所述細胞懸液中分批加入底物3-氰基吡啶，控制反應體系中3-氰基吡啶的濃度≤90g/L，進行水合反應，得到產物煙酰胺。

2.如權利要求1所述的生產工藝，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌E. coli BL21(DE3)。

3.如權利要求1所述的生產工藝，其特征在于，所述菌種活化的過程，包括：將基因工程菌菌株接種至固體培養基上進行活化培養；

所述活化培養的溫度為35~37℃，時間為8~16h；所述固體培養基為：LB-Kan固體培養基，10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母抽提物，10 g/L氯化鈉，pH 7.0，20g/L瓊脂粉，卡那霉素濃度為50 μg/mL。

4.如權利要求1所述的生產工藝，其特征在于，所述種子培養的過程，包括：將活化后的菌種接種至一級種子培養基中，進行一級培養；再接種至二級種子培養基中進行二級培養；所述一級培養的溫度為35~37℃，時間為8~24h；所述二級培養的溫度為35~37℃，時間為3~12h；所述一級種子培養基為LB培養基，10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母抽提物，10 g/L氯化鈉，pH 7.0，卡那霉素濃度為50 μg/mL；所述二級種子培養基為12 g/L蛋白胨，24g/L酵母抽提物，16.43 g/L K₂HPO₄·3 H₂O，2.31 g/L KH₂PO₄，5.04 g/L甘油，卡那霉素濃度為50 μg/mL。

5.如權利要求1所述的生產工藝，其特征在于，以腈水合酶酶活計，所述細胞懸液中重組腈水合酶基因工程菌的添加量為5 ~10萬U/L。

6.如權利要求1所述的生產工藝，其特征在于，所述水合反應的溫度為15~25℃；反應體系的pH值為6.5~8.5。

7.如權利要求1所述的生產工藝，其特征在于，步驟（B）中，分批加入的次數為4~8次。