[發明專利]一種檢測玉蜀黍黑粉菌的方法及專用試劑盒

有效

• 申請號: 201710962042.7
• 申請日: 2017-10-16
• 公開（公告）號: CN107828906B
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 曹言勇;李會勇;馬娟;王利鋒;李晶晶
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;白艷

本發明公開了一種檢測玉蜀黍黑粉菌的方法及專用試劑盒。本發明提供了檢測玉蜀黍黑粉菌的環介導等溫擴增成套引物由引物Pep?F3?2、引物Pep?B3?2、引物Pep?FIP(F1c+F2)?2、引物Pep?BIP(B1c+B2)?2、引物Pep?LoopF?2和引物Pep?LoopB?2組成；本發明的方法可用于田間樣品檢測，為玉米常見病害防治和抗性育種提供基礎。本發明開發的LAMP檢測體系可為玉米瘤黑粉病綜合防治提供有效指導，避免病害進一步發生，同時也是植物—病原物分子互作，抗病育種相關研究工作的重要輔助手段。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種檢測玉蜀黍黑粉菌的方法及專用試劑盒。

背景技術

由玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)侵染引起玉米瘤黑粉病是玉米上的主要病害之一。在我國玉米主要產區，該病平均發病率在5％至10％之間，嚴重發生時可達20％。包括作物輪作、種衣劑處理、殺菌劑葉面噴施和生物防治等防治措施并不能有效控制該病害的發生。種植抗病品種被認為是有效預防該病發生的唯一途徑，然而，目前并無可用的抗病品種或自交系。因此，建立一種有效、便捷的玉蜀黍黑粉菌快速檢測體系對該病的防控和抗病育種顯得尤為重要。除了是玉米生產上重要的病原物，玉蜀黍黑粉菌作為重要的模式植物病原真菌，廣泛應用于活體營養擔子菌與寄主植物的分子互作研究中。故而，玉蜀黍黑粉菌檢測體系也可應用于該病菌與寄主互作研究中，以評估病害侵染不同事件中，病害的發生程度。

目前對U.maydis的常用檢測方法有形態學鑒定、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、聚合酶鏈反應(PCR)等。這些方法在一定程度上存在操作繁雜、費時等缺點。此外，其不能作為快速和定量分析病原體的工具。環介導等溫擴增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)測定是一種新型的核酸擴增方法，在具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶作用下，使用1組4或6條序列特異性的引物，識別靶標DNA上至少6個不同區域，以產生含有單鏈環的擴增產物，不需要重復循環的熱變性。

發明內容

本發明一個目的是提供檢測玉蜀黍黑粉菌的環介導等溫擴增成套引物。

本發明提供的成套引物由引物Pep-F3-2、引物Pep-B3-2、引物Pep-FIP(F1c+F2)-2、引物Pep-BIP(B1c+B2)-2、引物Pep-LoopF-2和引物Pep-LoopB-2組成；

所述引物Pep-F3-2、引物Pep-B3-2、引物Pep-FIP(F1c+F2)-2、引物Pep-BIP(B1c+B2)-2、引物Pep-LoopF-2和引物Pep-LoopB-2的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。

上述成套引物中，所述引物Pep-F3-2、所述引物Pep-B3-2、所述引物Pep-FIP(F1c+F2)-2、所述引物Pep-BIP(B1c+B2)-2、所述引物Pep-LoopF-2和所述引物Pep-LoopB-2的摩爾比為1:1:8:8:4:4。

本發明另一個目的是提供檢測玉蜀黍黑粉菌的環介導等溫擴增試劑。

本發明提供的試劑，包括鏈置換型DNA聚合酶、環介導等溫擴增緩沖液和上述的成套引物。

上述試劑中，所述引物Pep-F3-2、所述引物Pep-B3-2、所述引物Pep-FIP(F1c+F2)-2、所述引物Pep-BIP(B1c+B2)-2、所述引物Pep-LoopF-2和所述引物Pep-LoopB-2的濃度分別為0.2μM、0.2μM、1.6μM、1.6μM、0.8μM和0.8μM。

上述試劑中，所述鏈置換型DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。