[發明專利]一種切割效率增強的HRV 3C蛋白酶底物突變體及其應用

有效

• 申請號: 201710956966.6
• 申請日: 2017-10-16
• 公開（公告）號: CN107602706B
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 易犁;范賢;彭文舫;周瑜;喻嬋;張桂敏
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C07K1/14;C12R1/19
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 強紅剛

本發明利用酵母內質網滯留篩選系統(YESS)快速解析蛋白酶底物切割位點特異性，最終提供了一種切割效率增強的HRV 3C蛋白酶底物序列突變體及其應用。該底物變體包含序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其在蛋白純化過程中移除純化標簽中具有較好的實際應用優勢，從而有利于HRV 3C蛋白酶的進一步應用和研究。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體而言，涉及一種切割效率增強的HRV 3C蛋白酶底物序列突變體及其應用。

背景技術

人鼻病毒(HRV)是單股正鏈小RNA病毒，其編碼的3C蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶家族，可以識別多肽序列LEVLFQ↓GP，并在Gln和Gly之間進行切割。HRV 3C蛋白酶具有特異性強，酶活高等特性，即使在4℃低溫條件下依然有較高的酶活。目前，HRV 3C蛋白酶已廣泛商品化，特別是用來在蛋白純化過程中移除純化標簽。然而，作為一種高價值的商業酶，HRV3C蛋白酶的底物特異性還沒有相關報道。

另外，蛋白酶底物切割位點特異性的研究是全面了解和應用蛋白酶的一個必要的過程，而傳統的研究方法是定點突變后，表達、純化得到相應底物突變體，然后進行體外反應，檢測、定量分析。該方法工作量大，操作復雜，效率低，操作誤差大，不利于實驗的高效開展，因此很難篩選得到切割效率增強的HRV 3C蛋白酶底物序列突變體。

發明內容

鑒于現有技術的不足，本發明開發了一種利用酵母內質網滯留篩選系統(YESS)來快速解析蛋白酶底物切割位點特異性的新方法--YESS-PSSC。

酵母內質網滯留信號肽(ERS,ER sequestration signal)是存在于蛋白羧基端的一段6個氨基酸長度的多肽(FEHDEL)，它可以與內質網內膜上的蛋白相互作用，使攜帶滯留信號肽的蛋白往返穿梭于內質網與高爾基體中以延長蛋白在內質網與高爾基體中的滯留時間，增加酶動力學范圍。Aga2為釀酒酵母表面的α凝集素成分，外源蛋白可借助與Aga2的融合表達而在酵母細胞表面被展示；所使用的熒光標簽分別是FLAG和HA，對應的氨基酸序列分別是DYKDDDDK和YPYDVPDYA，當各自對應的熒光抗體Anti-FLAG-APC和Anti-HA-FITC與之相結合時，根據底物的不同切割情況，可通過流式細胞儀檢測到相應的熒光信號。

在帶內質網滯留信號肽和不帶內質網滯留信號肽兩種情況下，都得到HRV 3C-P底物P1、P1’、P2’3個位點各3種突變體底物。其中，特異性最高的P1位點包括氨基酸為Q、N、F的3種底物，特異性較高的P1’位點包括氨基酸為G、A、D的3種底物，特異性較低的P2’位點包括氨基酸為P、F、W的3種底物,然后讓酶和底物復合體在內質網中發生反應，不同切割情況的底物會展示在細胞表面。當發明人用對應的熒光抗體Anti-FLAG-APC和Anti-HA-FITC孵育細胞時，不被切割的底物復合體可以同時被兩種熒光抗體Anti-FLAG-APC和Anti-HA-FITC標記；而被切割的底物復合體只能被熒光抗體Anti-FLAG-APC標記。所以，根據細胞表面展示底物的不同切割情況，流式細胞儀可以檢測到不同的信號，取一定量的細胞分析即可得到該底物突變體的切割效率。即說明可以利用酵母內質網滯留篩選系統(YESS)來解析蛋白酶底物切割位點特異性。結果表明：對于特異性高的P1和P1’位點底物突變體，展示時，酶和底物端都需要加內質網滯留信號肽(FEHDEL)；對于特異性低的P2’位點底物突變體展示時，酶和底物端都不需要加內質網滯留信號肽；則可以通過酵母內質網滯留信號肽的不同應用來解析HRV 3C蛋白酶針對其底物切割位點P1(Q),P1’(G),P2’(P)的特異性(參見圖2)。

因此，本發明利用酵母內質網滯留篩選系統(YESS)快速解析蛋白酶底物切割位點特異性，最終提供了一種切割效率增強的HRV 3C蛋白酶底物序列突變體及其應用，具體的技術方案概況如下：