[發明專利]基于分子生物學技術的蛹蟲草子囊孢子雜交育種方法

在審

• 申請號: 201710956892.6
• 申請日: 2017-10-16
• 公開（公告）號: CN107493979A
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發明（設計）人: 陽武雄;易思富;楊子遙;王衛;周豐;楊勝輝
• 申請（專利權）人: 常德炎帝生物科技有限公司
• 主分類號: A01G1/04
• 分類號: A01G1/04;C12N3/00;C12Q1/68;C12R1/645
• 代理公司: 上海諾衣知識產權代理事務所(普通合伙)31298
• 代理人: 劉紅祥

1.基于分子生物學技術的蛹蟲草子囊孢子雜交育種方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）在無菌條件下，將新鮮、成熟的蛹蟲草子實體懸于水瓊脂培養基上方，避免子實體與培養基接觸；所述蛹蟲草子實體由常德炎帝生物科技有限公司的菌種庫中大孢子頭品種、小孢子頭品種、尖頭孢子粉品種中的一種培植出的；

（2）將其轉移至生化培養箱中，21℃避光培養4-5天，使子囊孢子自然彈射到PDA培養基上；

（3） 在體式顯微鏡下挑取只有單個子囊孢子的菌落，再加入2ml的無菌水，攪拌均勻，制備成孢子懸液，取200微升的孢子懸浮液，涂布PDA平板培養基上，放置于21℃生化培養箱中避光培養；

(4)培養3-4天后，在超凈工作臺上選取肉眼可見的子囊孢子單菌落，轉移至新的PDA平板培養基上，每個PDA平板培養基上只培養單個菌落；

(5) 培養5天后，取純化的單個子囊孢子菌落提取其DNA，利用PCR擴增技術對提取的子囊孢子單菌落DNA進行交配型基因MAT1-1-1、MAT1-1-2和MAT1-2-1的檢測；

(6)配置營養液：由葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、牛肉膏0.5%、七水硫酸鎂0.1%、磷酸二氫鉀0.1%、維生素b1 0.001%、維生素b12 0.001%、水96.798%組成，混合均勻即可；

(7)將步驟（6）中營養液分裝至三角瓶中，高溫高壓滅菌20～30分鐘，取出冷卻至常溫備用；

(8)選取步驟（5）檢測的含有交配型基因MAT1-1-1和MAT1-1-2卻不含有MAT1-2-1的單孢子形成的菌落，與含有交配型基因MAT1-2-1卻不含有MAT1-1-1和MAT1-1-2的單孢子形成的菌落分別取2～5%大小的菌絲體塊接種于步驟（7）制好的營養液中，置于震蕩搖床中，設置19℃、避光、轉速150rpm搖瓶培養4-5天；

(9)將步驟（8）培養好的菌絲體接種于人工培養基上，轉移至溫度17～25℃、濕度65～85%的環境下，暗培養5～7天，待培養基表面長出大量白色菌絲；

(10)在步驟(9)的條件下，設置光照強度200～2000lux，進行見光轉色，經過原基生成、出蕾生長、出草生長三個階段，待蟲草子實體長至4～5cm高度，再將子實體采收即可。