[發明專利]一種去除單軸類蘭花內生菌的方法及在香莢蘭組織培養快速繁殖中的應用

有效

• 申請號: 201710954303.0
• 申請日: 2017-10-13
• 公開（公告）號: CN107581068B
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 吳坤林;鄭楓;曾宋君;張新華;馬國華;簡曙光
• 申請（專利權）人: 中國科學院華南植物園
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 郝文婷;劉明星

1.一種去除單軸類蘭花內生菌的方法，其特征在于，所述方法是使用利福平處理結合莖頂培養，去除單軸類蘭花組織培養過程中外植體材料存在的內生菌；

其中，所述利福平的配制方法是：用甲醇將醫用的利福平粉劑配制成25～50mg/L濃度的利福平溶液裝進已消毒滅菌的容器中，于4℃條件下保存待用；

所述的莖頂培養包括：

a、外植體的選擇、處理和培養：選取健康香莢蘭株系，以當年新萌生長的頂芽作為外植體，洗凈后剪去葉片和氣生根，在70％酒精中浸泡30s，用0.1％升汞溶液消毒5～10min，無菌水沖洗4～5次，切取高1～2cm帶節的頂芽，接種于頂芽促長培養基中，然后將所述25～50mg/L濃度的利福平溶液3～5ml加至所述頂芽促長培養基中，在(25±2)℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天條件下進行培養；

b、切頂、繼代培養：步驟a所述頂芽培養45天后，無菌條件下將所述頂芽的基部莖段切除，保留高1～2cm的頂芽插植到頂芽促長培養基中，將步驟a所述25～50mg/L濃度的利福平溶液3～5ml加至所述頂芽促長培養基中，在25±2℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天條件下進行培養45天，然后重復繼代培養2次，得到無菌的頂芽。

2.一種香莢蘭組織培養快速繁殖方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)無菌利福平溶液的配制：用甲醇將醫用的利福平粉劑配制成25～50mg/L濃度的利福平溶液裝進已消毒滅菌的容器中，于4℃條件下保存待用；

(2)外植體的選擇、處理和培養：選取健康香莢蘭株系，以當年新萌生長的頂芽作為外植體，洗凈后剪去葉片和氣生根，在70％酒精中浸泡30s，用0.1％升汞溶液消毒5～10min，無菌水沖洗4～5次，切取高1～2cm帶節的頂芽，接種于頂芽促長培養基中，然后將步驟(1)所述25～50mg/L濃度的利福平溶液3～5ml加至所述頂芽促長培養基中，在(25±2)℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天條件下進行培養；

(3)切頂、繼代培養：步驟(2)所述頂芽培養45天后，無菌條件下將所述頂芽的基部莖段切除，保留高1～2cm的頂芽插植到頂芽促長培養基中，將步驟(1)所述25～50mg/L濃度的利福平溶液3～5ml加至所述頂芽促長培養基中，在(25±2)℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天條件下進行培養45天，然后重復繼代培養2次，得到無菌的頂芽；

(4)不定芽增殖培養：將步驟(3)所得無菌的頂芽轉接至增殖培養基中，在(26±2)℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天條件下進行培養，得到不定芽；

(5)不定根誘導及壯苗培養：把步驟(4)所得高3～4cm的不定芽插植至不定根誘導和壯苗培養基中，在(28±2)℃、光照度2000～3000lx、光照12h/天條件下進行培養60天，得到試管苗；

(6)移栽：將步驟(5)培養得到的試管苗在強光照下煉苗7天，取出試管苗，洗凈附著的培養基，用千分之一的高錳酸鉀溶液浸泡5min，以水苔為種植基質、于陰涼通風處對試管苗進行栽培；

其中，步驟(2)和步驟(3)中，所述頂芽促長培養基的pH為5.4～5.6，每升包括如下組分：花寶1號1～2g、花寶2號1～2g、七水硫酸亞鐵20～40mg、乙二胺四乙酸二鈉20～40mg、蛋白胨0.5～2g、椰子汁50～100mL、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、鹽酸硫胺素0.05～0.2mg、鹽酸吡哆醇0.4～0.8mg、煙酸0.4～0.8mg、6-芐基腺嘌呤0.1～0.5mg、萘乙酸0.1～0.5mg、蔗糖15～30g、瓊脂6～7g；

步驟(4)中，所述增殖培養基的pH為5.4～5.6，每升包括如下組分：花寶1號1～2g、花寶2號1～2g、七水硫酸亞鐵20～40mg、乙二胺四乙酸二鈉20～40mg、蛋白胨0.5～2g、椰子汁100～150mL、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、鹽酸硫胺素0.05～0.2mg、鹽酸吡哆醇0.4～0.8mg、煙酸0.4～0.8mg、6-芐基腺嘌呤3.0～5.0mg、萘乙酸0.1～0.5mg、蔗糖15～30g、瓊脂6～7g；

步驟(5)中，所述不定根誘導和壯苗培養基的pH為5.4～5.6，每升包括如下組分：花寶1號1～2g、蛋白胨0.5～2g、土豆泥40～80g、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、鹽酸硫胺素0.05～0.2mg、鹽酸吡哆醇0.4～0.8mg、煙酸0.4～0.8mg、萘乙酸0.2～0.5mg、蔗糖15～30g、瓊脂6～7g。