[發明專利]Cr(VI)還原菌的鑒定及其培養方法

在審

• 申請號: 201710950932.6
• 申請日: 2017-09-30
• 公開（公告）號: CN109593667A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發明（設計）人: 楊宗政;張潔;劉愛霖;劉瑩;曹曉樂;江鑫;劉森;孫星;黃曄璇
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.Cr(VI)還原菌的鑒定及其培養方法，其特征在于：其步驟是：

(1)培養基的制備

細菌培養基(LB)：稱取蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，葡萄糖5g，少量乳酸鈉，加入1000mL蒸餾水中，用NaOH和HCl調節pH至7.9左右，于115℃滅菌30min，冷卻后備用(固體培養基加入20g/L瓊脂)。

含Cr(VI)培養基：實驗中以重鉻酸鉀(K₂Cr₂O₇)作為Cr(VI)源，在已滅菌的細菌培養基中加入相應濃度的重鉻酸鉀(將重鉻酸鉀溶液跟液體培養基分別滅菌，冷卻后在超凈工作臺中將兩溶液混合在一起)，調至所需濃度。

(2)菌株分離

鉻還原菌從鉻污染土壤中分離。稱取10g土壤樣品于已滅菌的250mL錐形瓶中，加入50mL滅菌培養基，置于恒溫搖床中，30℃、150r·min^-1搖床培養24h，在LB液體培養基中逐步提高含Cr(VI)濃度，增加Cr(VI)還原菌的耐受性，用10倍稀釋法將其稀釋后涂布在固體培養基上進行菌株的分離篩選和培養。

(3)菌株篩選

通過測定菌株在不同Cr(VI)濃度下的OD₆₀₀對每一株分離菌株評估它的最低抑菌濃度來測定它的耐Cr(VI)能力，抑制細菌生長的最低濃度被認為是MIC(Minimum inhibitoryconcentration)。從樣品中分離得到8株菌株能耐受150mg/L、200mg/L Cr(VI)，并且培養液中Cr(VI)去除率可以達到50％以上。

(4)菌株鑒定

將菌株劃線接種于固體培養基，培養2-3d，通過革蘭氏染色法在顯微鏡下觀察菌落形態，并進行生理生化檢測。

將菌株液體培養24h，離心收集菌體，利用細菌基因組DNA提取試劑盒抽提基因組總DNA。使用16S rDNA通用引物27F：

5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：

5’-GGTTACCTTGTTACGACGACTT-3’，直接擴增菌體的16S rDNA片段。PCR擴增產物序列送由北京六合華大基因科技有限公司進行測序。

2.根據權利要求1所述的Cr(VI)還原菌的鑒定及其培養方法，其特征在于：其培養條件為pH7-9、接種量6％(體積分數)及30℃條件下，50mg/L的Cr(VI)在處理72h后，去除率可達89.4％。

3.根據權利要求1所述的Cr(VI)還原菌的鑒定及其培養方法，所篩選的ZJ-8菌株的16SrDNA序列具有最大同源性的菌株是Ochrobactrum tritici strain，同源性達99％。