[發(fā)明專利]Cr(VI)還原菌的鑒定及其培養(yǎng)方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710950932.6
• 申請日: 2017-09-30
• 公開（公告）號: CN109593667A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發(fā)明（設計）人: 楊宗政;張潔;劉愛霖;劉瑩;曹曉樂;江鑫;劉森;孫星;黃曄璇
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.Cr(VI)還原菌的鑒定及其培養(yǎng)方法，其特征在于：其步驟是：

(1)培養(yǎng)基的制備

細菌培養(yǎng)基(LB)：稱取蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，葡萄糖5g，少量乳酸鈉，加入1000mL蒸餾水中，用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH至7.9左右，于115℃滅菌30min，冷卻后備用(固體培養(yǎng)基加入20g/L瓊脂)。

含Cr(VI)培養(yǎng)基：實驗中以重鉻酸鉀(K₂Cr₂O₇)作為Cr(VI)源，在已滅菌的細菌培養(yǎng)基中加入相應濃度的重鉻酸鉀(將重鉻酸鉀溶液跟液體培養(yǎng)基分別滅菌，冷卻后在超凈工作臺中將兩溶液混合在一起)，調(diào)至所需濃度。

(2)菌株分離

鉻還原菌從鉻污染土壤中分離。稱取10g土壤樣品于已滅菌的250mL錐形瓶中，加入50mL滅菌培養(yǎng)基，置于恒溫搖床中，30℃、150r·min^-1搖床培養(yǎng)24h，在LB液體培養(yǎng)基中逐步提高含Cr(VI)濃度，增加Cr(VI)還原菌的耐受性，用10倍稀釋法將其稀釋后涂布在固體培養(yǎng)基上進行菌株的分離篩選和培養(yǎng)。

(3)菌株篩選

通過測定菌株在不同Cr(VI)濃度下的OD₆₀₀對每一株分離菌株評估它的最低抑菌濃度來測定它的耐Cr(VI)能力，抑制細菌生長的最低濃度被認為是MIC(Minimum inhibitoryconcentration)。從樣品中分離得到8株菌株能耐受150mg/L、200mg/L Cr(VI)，并且培養(yǎng)液中Cr(VI)去除率可以達到50％以上。

(4)菌株鑒定

將菌株劃線接種于固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)2-3d，通過革蘭氏染色法在顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，并進行生理生化檢測。

將菌株液體培養(yǎng)24h，離心收集菌體，利用細菌基因組DNA提取試劑盒抽提基因組總DNA。使用16S rDNA通用引物27F：

5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：

5’-GGTTACCTTGTTACGACGACTT-3’，直接擴增菌體的16S rDNA片段。PCR擴增產(chǎn)物序列送由北京六合華大基因科技有限公司進行測序。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Cr(VI)還原菌的鑒定及其培養(yǎng)方法，其特征在于：其培養(yǎng)條件為pH7-9、接種量6％(體積分數(shù))及30℃條件下，50mg/L的Cr(VI)在處理72h后，去除率可達89.4％。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Cr(VI)還原菌的鑒定及其培養(yǎng)方法，所篩選的ZJ-8菌株的16SrDNA序列具有最大同源性的菌株是Ochrobactrum tritici strain，同源性達99％。