[發明專利]新型環二核苷酸受體及其激動劑或抑制劑篩選的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201710949587.4
• 申請日: 2017-10-11
• 公開（公告）號: CN107619438B
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 廣州云啟科技有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/6888;G01N33/68;C12Q1/02
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

本發明提供了能表達新型的感受外源性的環二核苷酸的受體(STING亞型M)的重組載體，同時提供特異性的鑒定和檢測這個受體表達的方法和試劑盒；進一步提供以新基因STING亞型M為靶點的激活劑或抑制劑藥物篩選模型和試劑盒及其應用。本申請的篩選模型和試劑盒可以簡化篩選的步驟，提高篩選效率，并擴大可篩選藥物的范圍。

技術領域

本發明屬于生物工程領域以及藥物篩選領域，具體涉及一種感受外源性的環二核苷酸的受體、其編碼基因、載體、鑒定方法、表達量測量、穩定細胞系及在藥物篩選中的應用和相關試劑盒。

背景技術

環二核苷酸(包括細菌所產生的c-di-AMP和c-di-GMP以及哺乳動物細胞所產生的cGAMP)能夠通過激活STING-TBK1-IRF3信號通路從而刺激機體產生強烈的免疫應答。近年來的研究證明外源性的環二核苷酸能夠顯著增強疫苗的免疫反應，同時研究顯示外源性的環二核苷酸在抗腫瘤免疫治療中也有非常好的療效。外源性的環二核苷酸能在體外和體內激活CD4和CD8細胞的腫瘤特異性的攻擊效應，從而抑制腫瘤的生長。因此，環二核苷酸被認為是新的一代的疫苗佐劑以及腫瘤治療藥物。2015年3月底，諾華制藥(Novartis)和Aduro公司達成7.5億美元的交易，共同開發新的針對STING的靶向藥物。

環二核苷酸的受體被認為是位于細胞內的內質網(ER)上的蛋白STING亞型1，這個受體蛋白是由Tmem173基因所編碼產生。但由于細胞外環二核苷酸不能直接穿透細胞膜，而內質網又在細胞質內，外源性的環二核苷酸是如何通過細胞膜結構來激活在內質網上的受體蛋白STING亞型1一直未知。因此現有的理論體系不能解釋外源性的環二核苷酸是如何激活機體的免疫反應的，這導致在篩選環二核苷酸抑制劑和激活劑時為了使待篩選藥物接觸到細胞內質網上的STING亞型1，需要對細胞進行細胞膜通透步驟或者用脂質體來包裹待篩選藥物進行轉染，這大大降低了篩選的效率及可篩選藥物的范圍(例如待篩選藥物需要可以被脂質體所包裹)，同時也限制了進一步優化外源性的環二核苷酸作為疫苗佐劑以及抗腫瘤免疫治療的應用。

本發明旨在提供能表達新型的感受外源性的環二核苷酸的受體(稱為STING亞型M)的重組載體，同時提供特異性的鑒定和檢測這個受體表達的方法和試劑盒；進一步提供以新基因STING亞型M為靶點的藥物篩選模型和試劑盒及其應用。

發明內容

通過對于全轉錄組數據的分析，發明人發現Tmem173基因可編碼除了在細胞內質網上的傳統型STING(STING亞型1)之外，還可以編碼表達在細胞表面的其他STING亞型(發明人命名為人STING亞型M和小鼠STING亞型M，以下統稱STING亞型M)。通過5’RACE的方法，發明人確認了STING亞型M在人和小鼠體內以及廣泛腫瘤細胞系中的存在。體外研究發現，這些STING亞型M可以直接感受細胞外的環二核苷酸從而作為細胞外環二核苷酸的受體。細胞外的環二核苷酸可以激活STING亞型M從而激活下游的一型干擾素的啟動子進而促使一型干擾素的表達上調。因此，作為外源性的環二核苷酸的受體，STING亞型M是疫苗開發以及腫瘤免疫治療的重要藥物靶點。

發明人發現Tmem173基因編碼的STING亞型M位于細胞膜上以及內質網中，小鼠STING亞型M氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，人的STING亞型M氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

另一方面，本發明提供一種用于表達STING亞型M的重組載體，例如可以是pCMV6-Entry，其含有上述的DNA序列。

本發明還提供了一種能特異性鑒別以及測量STING亞型1和M mRNA水平的方法和試劑盒。本試劑盒檢測的基本原理是利用特異性的寡核苷酸引物，在逆轉錄酶、耐熱DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、高品質的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg2+等RT-PCR反應緩沖液，通過RT-PCR擴增實現靶核苷酸的擴增，從而實現分別快速、高效、特異、定量檢測STING亞型1和M mRNA水平的目的。