[發(fā)明專利]人源化基因改造動物模型的制備方法及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710948551.4
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN107955817B
• 公開（公告）日: 2020-02-28
• 發(fā)明（設計）人: 沈月雷;白陽;郭雅南;黃蕤;周小飛;張美玲
• 申請（專利權）人: 百奧賽圖江蘇基因生物技術有限公司;北京百奧賽圖基因生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/113;C07K14/705;C12N15/12;A01K67/027
• 代理公司: 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 張丹

1.一種用于制備BTLA基因人源化的靶向載體，其包含：a）與待改變的轉換區(qū)5’端同源的DNA片段，即5’臂，其選自BTLA基因基因組DNA的100-10000個長度的核苷酸；b）期望的供體DNA序列，其編碼供體轉換區(qū)；和c）與待改變的轉換區(qū)3’端同源的第二個DNA片段，即3’臂，其選自BTLA基因基因組DNA的100-10000個長度的核苷酸；其中，所述待改變的轉換區(qū)位于BTLA基因第2外顯子，所述期望的供體DNA序列如SEQ ID NO：35所示。

2.根據權利要求1所述的用于制備BTLA基因人源化的靶向載體，其特征在于，所述與待改變的轉換區(qū)5’端同源的DNA片段的序列如NCBI登錄號為NC_000082.6的第45237539-45239051位核苷酸所示；所述與待改變的轉換區(qū)3’端同源的第二個DNA片段的序列如NCBI登錄號為NC_000082.6的第45239358-45240854位核苷酸所示。

3.一種用于構建人源化非人動物的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列靶向非人動物Btla基因，同時所述sgRNA在待改變的非人動物Btla基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG-3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列規(guī)則，所述sgRNA在小鼠Btla基因的靶位點位于小鼠Btla基因的第2外顯子上，所述sgRNA靶向的5’端靶位點的序列如SEQ IDNO：1-8任一項所示，sgRNA靶向的3’端靶位點的序列如SEQ ID NO：9-14任一項所示。

4.根據權利要求3所述的用于構建人源化非人動物的sgRNA序列，其特征在于，所述非人動物為嚙齒動物。

5.根據權利要求4所述的用于構建人源化非人動物的sgRNA序列，其特征在于，所述嚙齒動物為小鼠。

6.一種包含權利要求3-5任一所述的sgRNA序列的構建體。

7.一種制備包含權利要求3-5任一所述sgRNA序列的sgRNA載體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）提供一種sgRNA序列，制備獲得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人動物Btla基因，同時所述sgRNA在待改變的非人動物Btla基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列規(guī)則；

（2）合成含有T7啟動子及sgRNA scaffold的片段DNA，并將所述片段DNA通過EcoRI和BamHI酶切連接至骨架載體上，經測序驗證，獲得pT7-sgRNA載體；

（3）將步驟（1）獲得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸變性、退火，形成可以連入步驟（2）所述的pT7-sgRNA載體的雙鏈；

（4）將步驟（3）中退火的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸分別與pT7-sgRNA載體進行鏈接，篩選獲得sgRNA載體。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，

（1）將序列如SEQ ID NO：1-8所示的任一項sgRNA靶序列和SEQ ID NO：9-14所示的任一項sgRNA靶序列，制備獲得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

（2）合成含有T7啟動子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7啟動子及sgRNAscaffold的片段DNA如SEQ ID NO：23所示，將上述片段通過EcoRI和BamHI酶切連接至骨架載體上，經測序驗證，獲得pT7-sgRNA載體；

（3）分別合成步驟（1）中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，將合成的sgRNA寡聚核苷酸變性、退火，形成可以連入步驟（2）所述的pT7-sgRNA載體的雙鏈；

（4）將步驟（3）中退火的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸分別與pT7-sgRNA載體進行鏈接，篩選獲得sgRNA載體。