[發(fā)明專利]一種以人MUC13作為肝細胞癌特異標志物的檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710947982.9
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN107557470A
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發(fā)明（設計）人: 戴永東;劉璐璐;趙鵬;關新元
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司33101
• 代理人: 王洪新,王之懷

技術領域

本發(fā)明涉及生物領域，具體是以人黏蛋白基因MUC13作為肝細胞癌特異標志物的檢測方法。

背景技術

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC,簡稱肝癌),是世界上第五高發(fā)的惡性腫瘤，致死率位列第三。目前我國的肝癌患者人數居高不下，約占全球肝癌病人的55％，嚴重影響人們的身體健康。

目前肝癌診斷除了傳統的病理學診斷及影像學輔助診斷外，分子診斷方興未艾，為個體化判斷患者疾病亞型及疾病進展情況提供有力證據。常見的肝癌分子診斷標記物有：甲胎蛋白、熱休克蛋白70、磷脂酰肌醇、γ-谷氨酰轉移酶、轉化生長因子(TGF-β1)及胰島素樣生長因子II等。

傳統的病理學診斷及影像學輔助診斷對肝癌疾病具有可靠的診斷效力，但卻缺乏個體化提示作用，也對腫瘤的基因相關信息沒有任何提示作用，也因此無助于后續(xù)的基因靶向治療。而已有的肝癌分子診斷標記物包括常用的甲胎蛋白等，其假陽性率和假陰性率較高，容易造成誤診或漏診。

判斷肝癌患者預后指標有許多，常用的為病理分期、臨床分期、治療轉歸等。此外眾多基因被發(fā)現對肝癌患者預后具有提示作用，如血清甲胎蛋白、腫瘤組織p53、細胞角蛋白10/19、骨橋蛋白、Dickkopf-1等，但目前尚未找到最佳指標或組合。因此進一步尋找其特異性分子標志物有重要的臨床意義。

發(fā)明內容

本發(fā)明所要解決的技術問題是克服上述背景技術的不足，提供一種以人MUC13作為肝細胞癌特異標志物的檢測方法，該方法通過對人MUC13的定量檢測，獲得肝細胞癌的相關信息，并能根據檢測中采用的PCR擴增結果開展基于肝癌MUC13表達水平的患者生存時間預測。

本發(fā)明提供的技術方案是：

一種以MUC13作為肝細胞癌特異標志物的檢測方法，包括以下步驟：

1)從被檢人群獲取人體組織樣本，然后進行RNA提取及逆轉錄；

2)檢測人體組織樣本中的MUC13；

3)若被檢組織樣本中MUC13ΔCT低于正常組織樣本MUC13ΔCT平均值的，則提示被檢組織樣本中具有癌肝細胞；

所述步驟2中的檢測通過熒光實時定量核酸擴增檢測(QPCR)進行；所采用的MUC13熒光實時定量PCR(QPCR)引物為：

正向5’-CCTTCGGTGTGATTATTATGGC-3′

反向5′-GCATCTGGCTGTCTCTGGAG-3′。

所述步驟2中的QPCR，采用的對照引物為：

正向5’-CTCTTAGCTGAGTGTCCCGC-3′

反向5′-CTGATCGTCTTCGAACCTCC-3′。

作為推薦，所述步驟2中，正常組織樣本的MUC13ΔCT平均值為15.5。

所述步驟1)中的RNA提取及逆轉錄，包括利用Trizol進行RNA提取和利用RNA逆轉錄試劑盒逆轉成互補DNA(cDNA)。

所述MUC13PCR引物和對照引物合成時，采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法(PAGE)純化。

所述MUC13PCR引物和對照引物使用時，采用三蒸水稀釋至工作液濃度10μM。

本發(fā)明的有益效果是：

1)肝癌的分子標記物有許多，但特異性均不好。本發(fā)明發(fā)現MUC13在44.0％的肝癌患者中顯著升高，并與患者腫瘤包膜形成、腫瘤大小、癌栓形成和腫瘤分級相關等臨床參數相關，因此發(fā)明人認為MUC13可作為肝癌特異性分子標記物。

2)血清甲胎蛋白、腫瘤組織p53、細胞角蛋白10/19、骨橋蛋白、Dickkopf-1等均可作為肝癌患者的生存預判的分子指標，但預判價值都不盡理想，尋找疾病生存預判的指標具有重要意義。本發(fā)明發(fā)現MUC13表達高的患者平均生存時間為64.1±5.8個月，顯著低于MUC13表達低的患者的平均生存時間89.2±5.2個月。結果證明MUC13是可作為肝癌生存預判的良好的分子標記物。

附圖說明

圖1是MUC13蛋白在肝癌組織與肝正常組織中的表達水平比較圖(每個點代表一個樣品)。

圖2是MUC13蛋白在肝癌組織(Non-tumor)與肝正常組織(Normal)中的顯微照片比較圖。

圖3是MUC13蛋白在肝癌組織(T)與肝正常組織(N)中的Western檢測比較圖。

圖4是基于QPCR分析得到的MUC13表達水平對肝癌患者總生存時間(A)和無病生存時間(B)的Kaplan-Meier分析圖。