[發(fā)明專利]快速檢測(cè)DNA聚合酶3′-5′外切活性或錯(cuò)配的方法和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710947575.8
• 申請(qǐng)日: 2017-10-12
• 公開（公告）號(hào): CN109652499B
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王靜靜;章文蔚;陳奧;徐崇鈞;龔梅花;羅銀鈴;羅宇芬;李長(zhǎng)英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6816
• 分類號(hào): C12Q1/6816;C12Q1/34
• 代理公司: 深圳鼎合誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

1.一種快速檢測(cè)DNA聚合酶3'-5'外切活性或錯(cuò)配的方法，其特征在于，包括：

提供一段已知序列的核酸，以及針對(duì)一種待測(cè)脫氧核苷酸的檢測(cè)引物，該檢測(cè)引物與所述已知序列的核酸互補(bǔ)配對(duì)且3'羥基端的最后一個(gè)脫氧核苷酸和待聚合的前兩位脫氧核苷酸互不相同；

提供兩個(gè)反應(yīng)體系，使所述已知序列的核酸和所述檢測(cè)引物在其內(nèi)雜交，加入待測(cè)的DNA聚合酶以及帶熒光標(biāo)記的、與待聚合的脫氧核苷酸不同的脫氧核苷酸進(jìn)行反應(yīng)，然后清洗未被聚合的脫氧核苷酸，進(jìn)行第一次信號(hào)收集；

向所述兩個(gè)反應(yīng)體系中加入無(wú)外切活性的Taq DNA聚合酶，并且分別加入帶熒光標(biāo)記的第一位待聚合的脫氧核苷酸和帶熒光標(biāo)記的第二位待聚合的脫氧核苷酸進(jìn)行反應(yīng)，然后清洗未被聚合的脫氧核苷酸，進(jìn)行第二次信號(hào)收集；帶熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸的熒光標(biāo)記、第一位待聚合的脫氧核苷酸的熒光標(biāo)記以及第二位待聚合的脫氧核苷酸的熒光標(biāo)記互不相同；

提供第三個(gè)反應(yīng)體系，使所述已知序列的核酸和所述檢測(cè)引物在其內(nèi)雜交，加入所述待測(cè)的DNA聚合酶和帶熒光標(biāo)記的第一位待聚合的脫氧核苷酸進(jìn)行反應(yīng)，作為對(duì)照組；

綜合分析所述第一次信號(hào)和所述第二次信號(hào)，判斷所述待測(cè)的DNA聚合酶是否發(fā)生外切或錯(cuò)配；

若第一次信號(hào)收集時(shí)檢測(cè)不到信號(hào)或信號(hào)很低、接近背景，且第二次信號(hào)收集時(shí)能夠檢測(cè)到與第一位待聚合的脫氧核苷酸相同的熒光信號(hào)，則說(shuō)明待測(cè)的DNA聚合酶沒(méi)有外切和錯(cuò)配發(fā)生；若第一次信號(hào)收集時(shí)檢測(cè)到信號(hào)，且第二次信號(hào)收集時(shí)能夠檢測(cè)到與第一位待聚合的脫氧核苷酸相同的熒光信號(hào)，則說(shuō)明待測(cè)的DNA聚合酶發(fā)生了外切；若第一次信號(hào)收集時(shí)檢測(cè)到信號(hào)，且第二次信號(hào)收集時(shí)檢測(cè)到與第二位待聚合的脫氧核苷酸相同的熒光信號(hào)，則說(shuō)明待測(cè)的DNA聚合酶發(fā)生了錯(cuò)配；

所述一段已知序列的核酸為SEQ ID NO：1所示序列，所述檢測(cè)引物為SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：5所示序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)引物包括四種，分別針對(duì)A、C、G、T四種待測(cè)脫氧核苷酸。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述已知序列的核酸固定在磁珠或芯片上。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，使用鏈霉親和素和生物素將核酸固定在磁珠或芯片上。

5.一種快速檢測(cè)DNA聚合酶3'-5'外切活性或錯(cuò)配的試劑盒，其特征在于，包括：

一段已知序列的核酸，以及針對(duì)一種待測(cè)脫氧核苷酸的檢測(cè)引物，該檢測(cè)引物與所述已知序列的核酸互補(bǔ)配對(duì)且3'羥基端的最后一個(gè)脫氧核苷酸和待聚合的前兩位脫氧核苷酸互不相同；

與待聚合的脫氧核苷酸不同的帶熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸，用于在反應(yīng)池內(nèi)與待測(cè)的DNA聚合酶、所述已知序列的核酸和所述檢測(cè)引物一起進(jìn)行反應(yīng)以進(jìn)行第一次信號(hào)收集；

無(wú)外切活性的Taq DNA聚合酶、帶熒光標(biāo)記的第一位待聚合的脫氧核苷酸和帶熒光標(biāo)記的第二位待聚合的脫氧核苷酸，用于在反應(yīng)池內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)以進(jìn)行第二次信號(hào)收集；

帶熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸的熒光標(biāo)記、第一位待聚合的脫氧核苷酸的熒光標(biāo)記以及第二位待聚合的脫氧核苷酸的熒光標(biāo)記互不相同；

所述一段已知序列的核酸為SEQ ID NO：1所示序列，所述檢測(cè)引物為SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：5所示序列；

使用試劑盒進(jìn)行DNA聚合酶3'-5'外切活性或錯(cuò)配檢測(cè)時(shí)，若第一次信號(hào)收集時(shí)檢測(cè)不到信號(hào)或信號(hào)很低、接近背景，且第二次信號(hào)收集時(shí)能夠檢測(cè)到與第一位待聚合的脫氧核苷酸相同的熒光信號(hào)，則說(shuō)明待測(cè)的DNA聚合酶沒(méi)有外切和錯(cuò)配發(fā)生；若第一次信號(hào)收集時(shí)檢測(cè)到信號(hào)，且第二次信號(hào)收集時(shí)能夠檢測(cè)到與第一位待聚合的脫氧核苷酸相同的熒光信號(hào)，則說(shuō)明待測(cè)的DNA聚合酶發(fā)生了外切；若第一次信號(hào)收集時(shí)檢測(cè)到信號(hào)，且第二次信號(hào)收集時(shí)檢測(cè)到與第二位待聚合的脫氧核苷酸相同的熒光信號(hào)，則說(shuō)明待測(cè)的DNA聚合酶發(fā)生了錯(cuò)配。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)引物包括四種，分別針對(duì)A、C、G、T四種待測(cè)脫氧核苷酸。