[發(fā)明專利]一株基因工程菌乳酸乳球菌及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710944929.3
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN107805620B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅義勇;張柯
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/02;A23L3/3571;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種基因工程菌乳酸乳球菌及其應用，該基因工程菌乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000/pNZ8048?pdh，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC M 2017453；本發(fā)明基因工程菌經(jīng)乳酸鏈球菌素誘導，使預苯酸脫氫酶基因(pdh)在乳酸乳球菌NZ9000中高效表達，可顯著提高對羥基苯乳酸（OH?PLA）產(chǎn)量，加強對食源性病原菌的抑制能力；實驗證明，誘導后的基因工程菌發(fā)酵上清液，OH?PLA產(chǎn)量是未誘導的1.74?2.41倍，對食源性病原菌金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、尖孢鐮刀菌和擴展青霉的抑制率分別為39%、51%、66%和60%。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基因工程菌乳酸乳球菌及其應用，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

對羥基苯乳酸（OH-PLA），又稱3-（4-羥基苯基）乳酸，是一種廣泛存在自然界中的小分子天然有機酸；可以抑制多種病原菌的生長，被認為是一種新型生物防腐劑。OH-PLA穩(wěn)定性好，熔點為106~110℃，親水性比較大，能在食品體系中均勻擴散，在食品防腐領(lǐng)域顯現(xiàn)巨大潛力。

對羥基苯乳酸廣泛存在于各種傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，是傳統(tǒng)發(fā)酵食品優(yōu)勢菌群---乳酸菌的一種主要代謝產(chǎn)物。乳酸菌是公認的食品級安全微生物，因其可以定居于人類腸道且有益于人體健康，經(jīng)常作為益生菌應用于食品、保健品和藥品等領(lǐng)域。從分類學上看，乳酸菌包含43個屬，約373個種和亞種。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是乳酸菌兩個常見種。

目前OH-PLA的生產(chǎn)方法主要有化學合成法和微生物發(fā)酵法。在微生物發(fā)酵法中，改變優(yōu)化發(fā)酵底物和發(fā)酵條件以提高OH-PLA產(chǎn)量是研究的主流，而通過基因工程手段改變OH-PLA生物合成路徑的研究只有一例。Koma等人（2012）通過在大腸桿菌（Escherichia coli）中導入乳酸脫氫酶基因，使發(fā)酵上清中的OH-PLA含量顯著增加。

本發(fā)明利用基因工程手段，從植物乳桿菌L8（分離于豆豉---一種中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品）中克隆預苯酸脫氫酶基因（pdh），將該基因連接到表達質(zhì)粒pNZ8048上，再轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌NZ9000中，得到重組表達菌株NZ9000/pNZ8048-pdh，該基因工程菌經(jīng)乳酸鏈球菌素（nisin）誘導，使pdh在乳酸乳球菌中高效表達，可提高OH-PLA產(chǎn)量，加強對食源性病原菌抑制性。因pdh來源和異源表達菌株均是食品級微生物以及OH-PLA自然存在于各種傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，所以本發(fā)明獲得的OH-PLA是一種天然的、安全無毒的新型食品防腐劑，在食品防腐領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。經(jīng)文獻檢索，未見與本發(fā)明相同的公開文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基因工程菌乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000/pNZ8048-pdh，該基因工程菌已于2017年8月28日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏單位地址：中國.武漢.武漢大學；保藏號為CCTCC NO：M 2017453。

本發(fā)明利用PCR技術(shù)從食源性乳酸菌中擴增預苯酸脫氫酶基因（pdh），該基因與表達載體pNZ8048連接后，將得到的重組表達載體pNZ8048-pdh轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌NZ9000細胞內(nèi)中，通過氯霉素抗性篩選獲得pdh異源表達基因工程菌NZ9000/pNZ8048-pdh。