[發明專利]一種具有抗腫瘤活性的底泥微生物

在審

• 申請號: 201710941327.2
• 申請日: 2017-10-11
• 公開（公告）號: CN107603889A
• 公開（公告）日: 2018-01-19
• 發明（設計）人: 孫坤來;初雪梅;劉文;梁麗麗;王斌;陳蔭;趙玉勤
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P1/02;A61K36/068;A61P35/00;C12R1/645
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙)33213
• 代理人: 吳秉中

技術領域

本發明涉及微生物領域，尤其是涉及一種具有抗腫瘤活性的底泥微生物。

技術背景

腫瘤是機體在各種致瘤因素作用下，局部組織的細胞在基因水平上失去對其生長的正常調控導致異常增生與分化而形成的新生物，因為這種新生物多呈占位性塊狀突起，也稱贅生物。新生物一旦形成，不因病因消除而停止生長，他的生長不受正常機體生理調節，而是破壞正常組織與器官，這一點在惡性腫瘤尤其明顯。與良性腫瘤相比，惡性腫瘤生長速度快，呈浸潤性生長，易發生出血、壞死、潰瘍等，并常有遠處轉移，造成人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發熱以及嚴重的臟器功能受損等，最終造成患者死亡。腫瘤疾病在臨床上具有高致死率的一大疾病，尋找新型抗生素是一項刻不容緩的任務。從天然產物中尋找藥物具有悠久的歷史和傳統，其中微生物來源的抗生素具有巨大的潛力。

關于從微生物代謝產物中分離提取活性物質用于抗腫瘤的技術有很多方法，現有技術如授權公眾號為CN 102008465 B的中國發明專利，公開了一種海洋微生物來源大環內酯類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用，該發明方法提供了一種海洋微生物來源大環內酯類化合物Macrolactin Q在制備抗腫瘤藥物中的應用，Macrolactin Q在微克濃度水平對多種人腫瘤細胞株和動物瘤株有強烈的細胞毒作用，對動物瘤株裸鼠移植瘤模型有強烈的抗腫瘤作用，但是改發明方法中對活性化合物的提取步驟過于繁瑣，難易規模化生產，而且該提取步驟中含有氯仿、甲醇、乙腈等毒副物質。

發明內容

本方法的目的在于提供一種具有抗腫瘤活性的底泥微生物，底泥微生物產生抗腫瘤活性物質的產率較高，其提取方法簡單易操作，提取出的活性物質具有很強的抗腫瘤活性。

本發明針對背景技術中提到的問題，采取的技術方案為：一種具有抗腫瘤活性的底泥微生物，從中國浙江省舟山市六橫鎮美國紅魚養殖池底泥中分離篩選獲得，經18sRNA測序后提交到美國國家生物技術信息中心（NCBI）系統，NCBI系統會自動比對基因序列相似度，選取相似度99%以上的菌種經一一比對生物性狀相似度，最終鑒定結果為Cordyceps cylindrica SKL-1真菌。

從上述Cordyceps cylindrica SKL-1真菌分離提取具有抗腫瘤活性物質的方法包括以下步驟：

種子液培養：無菌條件下，將Cordyceps cylindrica SKL-1真菌接種入消過毒的安剖瓶中，用無菌細管吸取3-4mL培養液置于安剖瓶中，使凍干菌體溶解成懸浮狀；將活化后的Cordyceps cylindrica KL-1真菌接種入斜面培養基中，在32-35℃條件下恒溫培養48-96小時，加入培養基等量的無菌蒸餾水即得種子液；將Cordyceps cylindrica SKL-1真菌活化可以使真菌迅速適應培養環境，使真菌從凍干的休眠狀態迅速進入激活狀態，進一步進行種子液培養可以使真菌迅速恢復到活力旺盛的狀態，得到純而壯的培養物，為進一步的擴大發酵培養做準備；

擴大發酵培養：在發酵培養液中接種入3-5%的種子液，將發酵培養液放置在氣浴恒溫振蕩器中進行搖床發酵擴大培養，發酵溫度為26-29℃，搖床轉速為170-190r/min，發酵培養36-72小時；發酵培養可以使Cordyceps cylindrica SKL-1真菌利用發酵培養液中足量的碳源、氮源、微量元素、生長因子等物質進行生長繁殖及新陳代謝，并且在發酵培養中后期代謝分泌出大量的次級代謝產物，為次級代謝產物中活性物質的提取做準備；

提取活性物質：將擴大發酵培養得到的發酵液用等體積的乙酸乙酯滅活處理，將滅活后的發酵液在1000-1500r/min轉速下攪拌，抽濾2-3次濾除菌體；在濾液中加入1.2-1.5倍體積的乙酸乙酯進行萃取，萃取3-4次分離水相和有機相，每次萃取以雙頻率復合超聲波輔助，雙頻率復合超聲波的頻率分別為30-45kHz與65-80kHz、功率密度為0.45-0.60W/cm²,將每次萃取的上層類黃色澄清液體即有機相合并后冷凍干燥即得活性物質；高速攪拌可以使次級代謝產物與菌體分離，抽濾過濾掉菌體與不溶物，再通過萃取使活性物質溶解于有機相中，從而提取得到抗腫瘤活性物質；雙頻率復合超聲波輔助時，各自聲場所產生的空化泡不僅可以被自身聲場利用，還可以被另一聲場利用，雙頻超聲空化效應發生協同作用，遠遠優于單頻超聲甚至雙頻交替超聲，因此空化崩潰次數較多，有利于水溶性物質與油溶性物質的分離，輔助萃取完成抑菌活性物質的提取，提高提取效率。