[發明專利]一種用于檢測EGFR基因突變的擴增引物、測序引物、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201710940729.0
• 申請日: 2017-10-11
• 公開（公告）號: CN107653303A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發明（設計）人: 李葆華;蔣析文;劉悅;甘小洪;馬道亮
• 申請（專利權）人: 廣州立菲達安診斷產品技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 廣州天河澤睿專利代理事務所(普通合伙)44430
• 代理人: 劉曉鈺

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，更具體地，本發明涉及一種用于檢測EGFR 基因突變的擴增引物、測序引物、試劑盒和方法。

背景技術

EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是上皮生長因子(EGF)細胞 增殖和信號傳導的受體。EGFR屬于ErbB受體家族的一種，該家族包括EGFR (ErbB-1),HER2/c-neu(ErbB-2),Her 3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)。EGFR也被稱作 HER1、ErbB1，突變或過表達一般會引發腫瘤。EGFR是一種糖蛋白，屬于酪氨 酸激酶型受體，細胞膜貫通，分子量170KDa。EGFR位于細胞膜表面，靠與配 體結合來激活，包括EGF和TGFα(transforming growth factorα)。激活后， EGFR由單體轉化為二聚體，盡管也有證據表明，激活前也存在二聚體。EGFR 基因由28個外顯子組成。其酪氨酸激酶功能區由外顯子18-24編碼，迄今為止發 現的EGRF基因突變主要位于外顯子18-21。

肺癌是我國發病率和死亡率最高的癌癥，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占所有肺癌的80％。EGFR酪氨酸激酶抑制劑如吉非替尼 和厄洛替尼，能特異性地抑制具有EGFR基因突變的非小細胞肺癌的生長，改善 預后。因此，在使用酪氨酸激酶抑制劑治療前，《非小細胞肺癌臨床實踐指南》 推薦進行EGFR的突變檢測。

目前市場主要的檢測技術有：

EGFR基因突變的檢測主要有Sanger測序法、ARMS、FISH等。其中FISH技 術主要適用于拷貝數變異的檢測，同時由于操作過程繁瑣，該方法以逐漸顯現 其局限性；ARMS技術是目前國內應用最為廣泛的技術，但只能檢測已知的位點， 且要將樣本分成多個管進行實驗才能實現分型，對樣本量要求高；而Sanger測序 法是DNA序列分析的經典方法，最直接的、可檢測已知和未知突變的一種方法。 由于該方法可直接讀取DNA的序列，因此被認為是基因分型的金標準，其主要 優點是測序長度較長，可發現新的變異位點，包括一些新的少見的突變形式及 突變的確切類型，如點突變、片段缺失。所以探索一種Sanger測序法檢測EGFR 基因的技術具有重要的臨床意義。

發明內容

基于此，為了克服上述現有技術的缺陷，本發明提供了一種用于檢測EGFR 基因突變的擴增引物、測序引物、試劑盒和方法。

為了實現上述發明目的，本發明采取了以下技術方案：

一種用于檢測EGFR基因突變的擴增引物，所述擴增引物包括：針對EGFR 基因Exon18突變的SEQ ID No:1和SEQ ID No:2、針對EGFR基因Exon19突變的 SEQ ID No:3和SEQ ID No:4、針對EGFR基因Exon20突變的SEQ ID No:5和SEQ ID No:6、以及針對EGFR基因Exon21突變的SEQ ID No:7和SEQ ID No:8。

本發明還提供了一種用于檢測EGFR基因突變的測序引物，所述測序引物包 括：針對EGFR基因Exon18突變的SEQ ID No:9、針對EGFR基因Exon19突變的 SEQ ID No:10、針對EGFR基因Exon20突變的SEQ ID No:11、以及針對EGFR基 因Exon21突變的SEQ ID No:12。

本發明還提供了一種檢測EGFR基因突變的試劑盒，所述試劑盒包括上述擴 增引物和測序引物。

在其中一些實施例中，所述試劑盒還包括UNG(UDG)/dUTP體系，UNG (UDG)/dUTP體系是一種防污染體系，能消除因PCR產物污染引起的假陽性檢 測結果。

在其中一些實施例中，所述試劑盒還包括熱啟動Taq酶，熱啟動Taq酶采用 化學修飾，經95℃熱激15分鐘，Taq酶才能發揮作用，熱啟動Taq酶可減少引物 二聚體的形成增加反應特異性。

在其中一些實施例中，所述試劑盒還包括質控品，所述質控品為EGFR陰性 質控品、EGFR野生型陽性質控品、EGFR Exon19突變型陽性質控品、和EGFR Exon18突變型陽性質控品。

本發明還提供了檢測EGFR基因突變的方法，使用上述試劑盒進行檢測，包 括以下步驟：

(1)、提取、純化待測樣品中的DNA；

(2)、以上述DNA作為模板，利用擴增引物進行PCR擴增，獲得擴增產物， 純化擴增產物；