[發(fā)明專(zhuān)利]利用乙酸生產(chǎn)乙醇酸的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201710940646.1 | 申請(qǐng)日： | 2017-10-11 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN107603998B | 公開(kāi)（公告）日： | 2020-10-09 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 李正軍;陳靜;李良康;笪央央;李微 | 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人： | 北京化工大學(xué) |
| 主分類(lèi)號(hào)： | C12N15/70 | 分類(lèi)號(hào)： | C12N15/70;C12N1/21;C12P7/42;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245 | 代理人： | 關(guān)暢;張立娜 |
| 地址： | 100029 *** | 國(guó)省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 利用 乙酸 生產(chǎn) 乙醇 基因工程 及其 構(gòu)建 方法 應(yīng)用 | ||
1.制備用于生產(chǎn)乙醇酸的工程菌的方法，包括如下步驟：提高受體菌中乙酰輔酶A合成酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酸激酶、檸檬酸合酶、異檸檬酸裂解酶、異檸檬酸脫氫酶激酶、乙醛酸還原酶的表達(dá)和/或活性，且降低所述受體菌中蘋(píng)果酸合酶、乙醇酸氧化酶和異檸檬酸裂解酶阻遏蛋白的表達(dá)和/或活性，從而獲得所述用于生產(chǎn)乙醇酸的工程菌；所述受體菌為能夠以乙酸作為碳源生長(zhǎng)的菌；
所述受體菌為大腸桿菌；
所述“提高受體菌中乙酰輔酶A合成酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酸激酶、檸檬酸合酶、異檸檬酸裂解酶、異檸檬酸脫氫酶激酶、乙醛酸還原酶的表達(dá)和/或活性”是通過(guò)向所述受體菌中導(dǎo)入乙酰輔酶A合成酶的編碼基因、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的編碼基因、乙酸激酶的編碼基因、檸檬酸合酶的編碼基因、異檸檬酸裂解酶的編碼基因、異檸檬酸脫氫酶激酶的編碼基因和乙醛酸還原酶的編碼基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的；
所述“降低所述受體菌中蘋(píng)果酸合酶、乙醇酸氧化酶和異檸檬酸裂解酶阻遏蛋白的表達(dá)和/或活性”是通過(guò)敲除所述受體菌中蘋(píng)果酸合酶的編碼基因、乙醇酸氧化酶的編碼基因和異檸檬酸裂解酶阻遏蛋白的編碼基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的；
所述乙酰輔酶A合成酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列2的第70-2028位；
所述磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列3的第1347-3491位；
所述乙酸激酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列3的第70-1272位；
所述檸檬酸合酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1的第70-1353位；
所述異檸檬酸裂解酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列5的第70-1374位；
所述異檸檬酸脫氫酶激酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列5的第1557-3293位；
所述乙醛酸還原酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列4的第70-1008位；
所述蘋(píng)果酸合酶為蘋(píng)果酸合酶1和/或蘋(píng)果酸合酶2；所述蘋(píng)果酸合酶1的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列21；所述蘋(píng)果酸合酶2的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列22；
所述乙醇酸氧化酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列23；
所述異檸檬酸裂解酶阻遏蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列24；
所述乙酰輔酶A合成酶的編碼基因是通過(guò)序列表中序列2所示的DNA分子導(dǎo)入所述受體菌中的；
所述磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的編碼基因和所述乙酸激酶的編碼基因是通過(guò)序列表中序列3所示的DNA分子導(dǎo)入所述受體菌中的；
所述檸檬酸合酶的編碼基因是通過(guò)序列表中序列1所示的DNA分子導(dǎo)入所述受體菌中的；
所述異檸檬酸裂解酶的編碼基因和所述異檸檬酸脫氫酶激酶的編碼基因是通過(guò)序列表中序列5所示的DNA分子導(dǎo)入所述受體菌中的；
所述乙醛酸還原酶的編碼基因是通過(guò)序列表中序列4所示的DNA分子導(dǎo)入所述受體菌中的；
所述蘋(píng)果酸合酶1的編碼基因是通過(guò)λ-red同源重組的方式進(jìn)行敲除的，其中同源重組片段的核苷酸序列為序列表中序列6；
所述蘋(píng)果酸合酶2的編碼基因是通過(guò)λ-red同源重組的方式進(jìn)行敲除的，其中同源重組片段的核苷酸序列為序列表中序列7；
所述乙醇酸氧化酶的編碼基因是通過(guò)λ-red同源重組的方式進(jìn)行敲除的，其中同源重組片段的核苷酸序列為序列表中序列8；
所述異檸檬酸裂解酶阻遏蛋白的編碼基因是通過(guò)λ-red同源重組的方式進(jìn)行敲除的，其中同源重組片段的核苷酸序列為序列表中序列9。
2.由權(quán)利要求1所述的方法制備得到的用于生產(chǎn)乙醇酸的工程菌。
3.權(quán)利要求2中所述工程菌在以乙酸作為底物生產(chǎn)乙醇酸中的應(yīng)用。
4.一種生產(chǎn)乙醇酸的方法，包括如下步驟：以乙酸作為碳源，發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求2中所述工程菌，收集發(fā)酵產(chǎn)物，從中獲得乙醇酸。
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