[發明專利]一種用于擴增人間充質干細胞的培養基及其擴增方法

在審

• 申請號: 201710940251.1
• 申請日: 2017-10-11
• 公開（公告）號: CN107653225A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發明（設計）人: 趙翔;宋彩霞;曹玉昊;葉勁濤;王仁杰;黃啟程;邱陽;李國焱;唐玲;胡小東
• 申請（專利權）人: 重慶金時代生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產權代理有限公司50219
• 代理人: 高姜

1.一種用于擴增人間充質干細胞的培養基，其特征在于，包括基礎培養基和添加于培養基中的添加劑，所述添加劑包括以下終濃度的組分：亞油酸2-10μL/mL、人源AB型血清5-15μL/mL、人轉鐵蛋白5-15μg/mL、L-谷氨酰胺1.5-3mmol/mL、維生素C 2-5mg/mL、葡萄籽提取物0.5-1mg/mL、紅景天苷1-5mg/mL、人參皂苷5-10mg/mL、枸杞多糖2-5mg/mL、東當歸酞內酯0.2-0.6mg/mL、血小板衍生生長因子0.1-0.2μL/mL和表皮細胞生長因子0.1-0.2μL/mL。

2.根據權利要求1所述的用于擴增人間充質干細胞的培養基，其特征在于，所述添加劑包括以下終濃度的組分：亞油酸8μL/mL、人源AB型血清10μL/mL、人轉鐵蛋白10μg/mL、L-谷氨酰胺2.2mmol/mL、維生素C 3mg/mL、葡萄籽提取物0.8mg/mL、紅景天苷3mg/mL、人參皂苷6mg/mL、枸杞多糖3mg/mL、東當歸酞內酯0.3mg/mL、血小板衍生生長因子0.1μL/mL和表皮細胞生長因子0.2μL/mL。

3.根據權利要求1或2所述的用于擴增人間充質干細胞的培養基，其特征在于，所述基礎培養基為DMEM/F12培養基。

4.根據權利要求1或2所述的用于擴增人間充質干細胞的培養基，其特征在于，所述紅景天苷通過以下方法制備得到：將紅景天與水以固液比為1-2：20-30混合，常溫浸泡0.5-1h，然后煎煮0.5-1h，過濾，再向藥渣中加入藥渣6-8倍重量的水，繼續煎煮0.5-1h，過濾，合并兩次濾液，然后濃縮至相對密度為1.1-1.2，最后加乙醇使含醇量的體積百分比為70-75％，攪拌，靜置，過濾，濾液濃縮至相對密度為1.1-1.2，然后干燥并除去乙醇，制得。

5.采用權利要求1-4任一項所述的培養基對人間充質干細胞進行擴增的擴增方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)人間充質干細胞原代分離培養

從臍帶或胎盤分離出人間充質干細胞，或從骨髓血、臍帶血或胎盤血中分離出單個核細胞，置于培養基中進行分離純化培養；

(2)擴增培養

將步驟(1)分離純化培養后的細胞再置于新鮮的培養基中進行傳代培養。

6.根據權利要求5所述的人間充質干細胞的擴增方法，其特征在于，步驟(1)具體過程如下：

①在無菌條件下，將臍帶或胎盤用PBS緩沖液清洗2-3次后，切碎，獲得組織碎塊，然后將組織碎塊加入含有0.05％胰酶和2mg/mLⅣ型膠原酶的酶液中，置于37℃消化過夜，過夜期間每隔3-5h混勻一次；

②去除步驟①中上清液，向消化后的組織中加入胰酶，置于37℃消化5-10min，然后加入培養基終止消化，最后離心，棄上清；

③將步驟②所得沉淀加入培養基中，37℃、5％CO₂培養箱中培養，每隔3-4天換一次培養基，待細胞融合度為70-80％時，用消化液消化細胞，然后離心，收集細胞。

7.根據權利要求6所述的人間充質干細胞的擴增方法，其特征在于，0.05％胰酶和2mg/mLⅣ型膠原酶的體積比為1：2-4。

8.根據權利要求5所述的人間充質干細胞的擴增方法，其特征在于，步驟(1)具體過程如下：

采集人骨髓血、臍帶血或胎盤血，利用淋巴細胞分離液分離并收集單個核細胞，然后將核細胞置于培養基中，調整細胞濃度為1-3×10⁶個/mL，然后置于37℃、5％CO₂條件下孵育24h后收集貼壁細胞，制得分離純化的間充質干細胞。