[發明專利]一種表達重組菌絲霉素的畢赤酵母

在審

• 申請號: 201710939331.5
• 申請日: 2017-10-11
• 公開（公告）號: CN107699507A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 梁偉凡;周玉巖;李洪金;丁小云
• 申請（專利權）人: 廣東海納川生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12P21/00;C12R1/84
• 代理公司: 深圳市君勝知識產權代理事務所(普通合伙)44268
• 代理人: 王永文

技術領域

本發明涉及生物技術和基因工程技術領域，特別涉及一種表達重組菌絲霉素的畢赤酵母。

背景技術

菌絲霉素（Plectasin）是由丹麥諾維信公司從腐生子囊菌假黑盤菌（Pseudoplectania nigrella）中分離得到的首例真菌防御素（專利WO 2003044049 A1）。菌絲霉素基因的完整開放閱讀框編碼一個長為95個氨基酸的多肽，共由3部分組成。信號肽序列（1～23位氨基酸）、前肽（24～55位氨基酸）和C-末端成熟肽（56～95位氨基酸）。成熟的菌絲霉素由40個氨基酸殘基組成，其二級結構屬于α-β模型，由一個α-螺旋和兩個反平行的β-折疊組成，其中包含三個二硫鍵(Cys4-Cys30，Cys15-Cys37，Cys19-Cys39)，其凈電荷數為+1～+3。NZ2114突變體是諾維信公司對菌絲霉素基因通過高通量突變篩選獲得的含3個氨基酸突變的變異體。與菌絲霉素相比，NZ2114突變體對金黃色葡萄球菌的抑制作用顯著提高。

菌絲霉素對革蘭氏陽性細菌具有明顯殺傷作用，包括：鏈球菌屬，葡萄球菌屬，腸球菌屬，棒狀桿菌屬和桿狀菌屬。尤其值得注意的是，菌絲霉素對肺炎鏈球菌的殺菌效果與萬古霉素和青霉素的殺菌效果相當。菌絲霉素具有良好的鹽離子耐受能力、pH穩定性和熱穩定性。同時，菌絲霉素無細胞毒性、無溶血性及腦脊液滲透性好，是治療革蘭氏陽性細菌引起的疾病的潛在藥物，具有廣闊應用前景。

菌絲霉素的生產方式主要有三種：提取、化學合成和生物合成。腐生子囊菌中的菌絲霉素含量非常少，因此通過提取方式獲得菌絲霉素是非常不經濟的。化學合成得到的菌絲霉素，由于無法形成二硫鍵，因此菌絲霉素的空間結構不正確，抑菌活性大幅減少。還需要后續操作重新形成二硫鍵，步驟繁瑣，價格昂貴，不適合大規模生產。生物合成主要通過基因工程手段構建工程菌株異源表達菌絲霉素，主要有原核表達和真核表達系統。中國專利授權號CN103374579B提供了一種菌絲霉素和硫氧還蛋白融合表達的大腸桿菌工程菌，搖瓶產量為0.124g/L融合蛋白。中國專利授權號CN104232712B提供了一種分泌表達菌絲霉素的釀酒酵母工程菌，搖瓶產量為0.143g/L總蛋白。中國專利申請號201611052836.1提供了一種菌絲霉素和SUMO融合表達的枯草芽孢桿菌工程菌，搖瓶產量為5.5mg/L菌絲霉素。上述表達系統的菌絲霉素產量都非常低。

畢赤酵母表達系統是最常用的蛋白表達系統之一，已有上千種蛋白在畢赤酵母中成功表達，并有多種蛋白實現工業化生產。中國專利授權號CN103045636B提供了一種分泌表達菌絲霉素的畢赤酵母工程菌，發酵罐產量為1.3g/L菌絲霉素。該專利通過單拷貝菌絲霉素表達載體pPICZαA-NZ2114整合至X-33畢赤酵母基因組，再通過博來霉素抗生素篩選高拷貝菌株。由于在一次轉化過程中表達載體在基因組中發生多次整合的概率極低，導致篩選菌株的基因拷貝數不高，所以通過該方法獲得的工程菌的菌絲霉素表達量低，篩選工作量大。同時，該表達載體是以AOX1啟動子作為整合為點，因此這些多拷貝菌株的載體整合片段都是相互鄰近的，在傳代過程中會由于同源重組的原因導致基因拷貝數逐漸減少，引起菌株不穩定。

可見，現有技術還有待改進和提高。

發明內容

鑒于上述現有技術的不足之處，本發明的目的在于提供一種重組菌絲霉素的畢赤酵母，旨在解決現有技術中通過畢赤酵母表達菌絲霉素的表達量低，篩選工作量大，而且菌株在傳代過程中基因拷貝數逐漸減少，菌株不穩定的問題。

為了達到上述目的，本發明采取了以下技術方案：

一種表達重組菌絲霉素的畢赤酵母,其中，該畢赤酵母分別經過三種不同菌絲霉素表達載體轉化，并且每次轉化得到的菌株選用不同的抗生素高拷貝篩選；

其中，所述菌絲霉素表達載體依次為：pTRP-NZ2114、pPIC9K-NZ2114、pPIC6αA-NZ2114。

所述的表達重組菌絲霉素的畢赤酵母，其中，所述的畢赤酵母為畢赤酵母X-33基因工程菌，所述菌絲霉素包括如SEQ ID No.1所示的DNA序列。

所述的表達重組菌絲霉素的畢赤酵母，其中，高拷貝篩選所述的菌絲霉素表達載體pTRP-NZ2114轉化感受態細胞后的篩選抗生素為0.25～4mg/mL的博來霉素。

所述的表達重組菌絲霉素的畢赤酵母，其中，所述菌絲霉素表達載體pTRP-NZ2114轉化的感受態細胞包括畢赤酵母X-33、畢赤酵母GS115、畢赤酵母SMD1168。