[發明專利]促進基因編輯T細胞活化及擴增的生物膜、制法及應用

在審

• 申請號: 201710939240.1
• 申請日: 2017-09-30
• 公開（公告）號: CN107794269A
• 公開（公告）日: 2018-03-13
• 發明（設計）人: 鄧濤;喻堃;徐國鋒;盧鈾
• 申請（專利權）人: 成都美杰賽爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N5/10;C12N5/0783;C07K14/705
• 代理公司: 成都玖和知識產權代理事務所(普通合伙)51238
• 代理人: 黎祖琴

1.一種促進基因編輯T細胞活化及擴增的重組生物膜制備方法，其特征在于，該重組生物膜通過如下步驟制備：

1)將修飾的CD137L基因序列通過基因重組方法導入到K562細胞基因組上，獲得在K562細胞表面穩定表達修飾CD137L蛋白的的穩轉株細胞，命名為rCD137L-K562細胞；

2)對步驟1)所述的rCD137L-K562細胞進行常規培養，通過細胞裂解液將細胞破碎，然后通過差速離心法獲得含有修飾CD137L蛋白的生物膜，再使用親和層析或親和磁珠分離的方法將含有修飾CD137L蛋白的生物膜片段進行富集提取、純化；

所述修飾的CD137L基因為NM_003811中第39位至第803位基因表示的CD137L的全基因序列和在CD137L基因終止密碼子(第801位至第803位)前加入蛋白標簽序列后所得的基因。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白標簽序列為6個His蛋白基因序列。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中所述的基因重組方法包括ZEN，TALENs、CRISPR-CAS9基因編輯方法中的一種。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因重組方法為CRISPR-CAS9基因編輯方法。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述富集提取、純化的方法為：

1)向所述rCD137L-K562細胞中加入細胞裂解液，將裂解液置于冰上30分鐘，細胞裂解液包含終濃度250mM的蔗糖、pH7.5且終濃度20MM的HEPES、終濃度10mM的KCl、終濃度1.5mM的EDTA、終濃度1mM的EGTA、質量體積比0.5％的蛋白酶抑制劑；

2)4℃條件下，1000G離心10分鐘，取上清；

3)4℃條件下，16000G離心10分鐘，取上清；

4)4℃條件下，100000G離心60分鐘，取上清；

5)將上述經差速離心獲得的細胞上清，用0.45um濾膜過濾；采用表面富含His抗體的磁珠純化含有rCD137L的重組細胞膜，分別用含20mM、50mM、100mM和400mM咪唑濃度的緩沖液進行階段洗脫，得到含有rCD137L膜蛋白的生物膜。

6.如權利要求1～5任一項所述方法制備得到的生物膜。

7.權利要求6所述的生物膜在促進基因編輯T細胞活化及擴增方面的應用，其特征在于，所述應用的方法包括以下步驟：將所述生物膜與體外培養的基因編輯T淋巴細胞接觸。