[發明專利]一種脂質體/凝膠復合型基因活化支架的制備方法

有效

• 申請號: 201710939210.0
• 申請日: 2017-10-11
• 公開（公告）號: CN107815470B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 沈海俊;王笑娜;陶安軍
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N15/88
• 分類號: C12N15/88
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種脂質體/凝膠復合型基因活化支架的制備方法，屬于生物醫學技術領域；本發明用TAT修飾脂質體作為高效的基因轉染載體，將其包載于MMPs敏感肽交聯的透明質酸凝膠中，從而構建一種內部包載脂質體的MMPs敏感型的基因活化支架；細胞在遷移和增殖的過程中分泌MMPs，使凝膠降解，一方面為細胞自身的遷移和增殖創造空間，避免凝膠的網狀結構成為細胞遷移和增殖的物理屏障，另一方面釋放出TAT?脂質體，對周圍細胞進行高效的原位轉染，從而表達并分泌生長因子，促進組織修復與再生。

技術領域

本發明涉及一種組織工程支架的制備方法，尤其涉及一種基質金屬蛋白酶敏感的脂質體/凝膠復合型基因活化支架的制備方法，屬于生物醫學技術領域。

背景技術

隨著醫學技術的迅猛發展，利用組織工程技術進行缺損組織和器官的修復與再生已成為一種極具潛力的治療手段，生長因子是組織工程中應用的重要的細胞營養物質，具有誘導和刺激細胞增殖、維持細胞存活等多方面的生物功能。然而，生長因子多為蛋白類藥物，其半衰期比較短，在體內容易失去生物活性，只能在短期內產生效果，此外，生長因子的價格昂貴，治療成本高昂。

近年來，基因治療技術的發展及其在組織工程領域的應用為這些問題的解決提供了新的策略。目前，關于GAM的研究熱點主要集中于仿生支架的設計以及如何實現高效的DNA轉染這兩個方面。將編碼有生長因子并具有轉染能力的DNA融合于生物可降解材料中構建含DNA的生物支架，即基因活化支架(gene-activated matrix，GAM)。將GAM直接植入到組織缺損區，可在植入部位釋放DNA并轉染附近的細胞。一旦轉染成功，細胞將成為生物反應器，持續表達并分泌基因所編碼的生長因子，達到對細胞分化和組織再生調控的目的。盡管目前使用的支架材料通常為生物可降解的，但支架的降解速率仍不能與細胞的遷移和增殖同步，限制了細胞在凝膠內的遷移和增殖，同時也使得包裹于支架內的DNA不能有效釋放出來轉染周圍細胞。此外，目前使用的基因轉染載體通常是陽離子聚合物，如聚乙烯亞胺PEI等，但其轉染效率較低，進一步限制了GAM的研究與應用。

凝膠是組織工程中常用的支架形式，其交聯網絡的多孔結構利于細胞的遷移以及活性物質的傳遞。但是，凝膠支架在為細胞提供生長微環境的同時，也成為了細胞遷移和增殖的物理屏障。盡管組織工程中所用的凝膠材料通常都是生物可降解的，如殼聚糖、海藻酸鈉、透明質酸等，但是在凝膠制備過程中所用的人工合成的聚合物交聯劑往往會影響凝膠的生物降解性能，使凝膠的降解速率不能與細胞的遷移和增殖同步，限制了細胞在凝膠內的遷移和增殖。

GAM需要將DNA復合物融合到支架材料中，因而，支架對DNA復合物的負載與有效釋放是至關重要的。利用凝膠包載基因實現基因的局部用藥已有廣泛研究。裸DNA已被成功地包載到膠原、普朗尼克/透明質酸、聚乙二醇、海藻酸鈉等材料制備的凝膠中，植入機體后實現了基因原位轉染和體內組織修復，但是裸DNA較低的轉染效率以及較慢的釋放速率限制了它們的應用。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)屬于細胞內的蛋白水解酶家族，在組織修復過程中，細胞能夠分泌MMPs，它幾乎能降解細胞外基質中的各種蛋白成分，從而為細胞的遷移與增殖提供空間。細胞穿膜肽TAT具有高效的入胞能力，能夠迅速破壞內吞體膜，逃逸溶酶體。TAT已經成功攜帶多種生物活性物質及載體，包括蛋白質、DNA、多肽、納米粒、脂質體等進行細胞內的傳輸，是一種新型而高效的藥物遞送工具。利用TAT修飾聚陽離子脂質體可以實現高效的基因轉染。

本發明用TAT修飾脂質體作為高效的基因轉染載體，將其包載于MMPs敏感肽(HS-MMP-SH)交聯的透明質酸凝膠中，從而構建一種內部包載脂質體的MMPs敏感型的基因活化支架。細胞在遷移和增殖的過程中分泌MMPs，使凝膠降解，一方面為細胞自身的遷移和增殖創造空間，避免凝膠的網狀結構成為細胞遷移和增殖的物理屏障，另一方面釋放出TAT-脂質體，對周圍細胞進行高效的原位轉染，從而表達并分泌生長因子，促進組織修復與再生。

發明內容