[發(fā)明專利]一種蜘蛛毒素殺蟲肽

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710937524.7
• 申請日: 2017-09-30
• 公開（公告）號: CN107586325A
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉中華;梁宋平;肖震
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南師范大學(xué)
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;A01P7/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化學(xué)中的多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及昆蟲電壓門控鈉通道抑制劑,殺蟲肽可作為農(nóng)業(yè)害蟲防治的應(yīng)用。

背景技術(shù)

農(nóng)業(yè)害蟲嚴(yán)重破壞了糧食供應(yīng)，并傳播了各種各樣的人類和動物病原體。雖然化學(xué)殺蟲劑是防治害蟲的主要手段，但目前很多害蟲產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性，導(dǎo)致有些害蟲再猖獗。同時農(nóng)藥殘留對環(huán)境和人類健康產(chǎn)生了很大影響。因此，我們迫切需要開發(fā)新的、安全的、更為高效并對環(huán)境無害的新型殺蟲劑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的旨在于提供一種以昆蟲離子通道為靶點并具備選擇性的殺蟲肽。

上述發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明提供的殺蟲肽來自于白額高腳蛛(Heteropoda venatoria)的蜘蛛粗毒，通過分離純化而得到的一種具有37個氨基酸殘基的多肽；由37個氨基酸殘基組成，含6個半胱氨酸形成的3對二硫鍵，分子量為4169.63Da，等電點4.27，氨基酸序列為：氨基酸序列為Asp Asp Asp Cys Gly Lys Leu Phe Ala Asp Cys Thr Ser Asp Ser Asp Cys Cys Glu Asn Trp Val Cys Ser Lys Thr Gly Phe Val Lys Asn Ile Cys Lys Tyr Asn Phe。

殺蟲肽對屬于昆蟲綱蜚蠊目的美洲蜚蠊具備較強(qiáng)致死活性。另外，具備較低的哺乳動物毒性，是進(jìn)行農(nóng)業(yè)害蟲防治的潛在分子。在高效防治農(nóng)業(yè)害蟲的同時，使用多肽類殺蟲劑可以避免傳統(tǒng)化學(xué)殺蟲劑對人類和環(huán)境的危害。

白額高腳蛛殺蟲肽的分離純化和制備方法

（1）殺蟲肽分離純化

白額高腳蛛用電刺激（5-10V 的脈沖電流）3-5s的方法采集毒液，于-70℃下冷凍干燥成白色粉末，再于-20℃低溫存放。10 mg的粗毒干粉用10 ml雙蒸水溶解后，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心五分鐘，取上清液進(jìn)行用C18 RP-HPLC進(jìn)行初步分離純化（圖1A）（大連依利特P230p制備型HPLC；反相制備柱：月旭，Ultimate XB-C18，5μm，4.6mm′250mm；洗脫液分別為：A液(0.1%TFA/H₂O)、B液（0.1%TFA/ACN）；洗脫梯度， 5-60 min, 5-60% B液； 流速，3 ml/min；溫度，25°C），在215 nm下監(jiān)測多肽的洗脫，收集星號洗脫峰，凍干。對星號洗脫峰進(jìn)一步細(xì)分（圖1B）（美國Waters HPLC 2795；反相分析柱：月旭，Ultimate XB-C18, 5 μm，4.6 mm′250 mm；洗脫液分別為：A液（0.1%TFA/H2O）、B液（0.1%TFA/ACN）；洗脫梯度， 12-38 min, 20-50% B液；流速：1 ml/min；溫度：25°C），在215nm下監(jiān)測多肽的洗脫，收集星號洗脫峰，凍干，并用質(zhì)譜測定其分子量。使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜MADI-TOF MS（AB SCIEX，美國）鑒定其分子量為45168.12 Da(圖1E)。使用自動Edman降解和cDNA文庫數(shù)據(jù)庫得到它的氨基酸序列為Asp Asp Asp Cys Gly Lys Leu Phe Ala Asp Cys Thr Ser Asp Ser Asp Cys Cys Glu Asn Trp Val Cys Ser Lys Thr Gly Phe Val Lys Asn Ile Cys Lys Tyr Asn Phe，包含六個半胱氨酸，是典型的ICK（抑制性半胱酸結(jié)）模體結(jié)構(gòu)。

（2）殺蟲肽的化學(xué)合成