[發明專利]一種高效擴增J亞群禽白血病病毒的方法

有效

• 申請號: 201710935163.2
• 申請日: 2017-10-10
• 公開（公告）號: CN107603957B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 葉建強;李拓凡;孫舒;邵紅霞;秦愛建;謝菁;呂璐
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N5/071
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 戴朝榮

本發明涉及一種高效擴增J亞群禽白血病病毒的方法，本發明采用雞肝細胞可高效擴增J亞群禽白血病病毒，利用雞肝細胞可以更早產生高滴度病毒的特性，縮短J亞群禽白血病病毒分離檢測時間，實現提早檢測到病原，提高J亞群禽白血病病毒檢測方法的敏感度。在J亞群禽白血病病毒感染MOI為0.001時，ELISA檢測感染維持培養3天的雞肝細胞的效果與感染維持培養7天的DF?1細胞相當。本發明建立發高效擴增方法的將加快J亞群禽白血病病毒的凈化進程，節約時間、成本，本發明在J亞群禽白血病病毒凈化檢測中具有很好的應用價值。

技術領域

本發明涉及免疫學領域，具體涉及一種高效擴增J亞群禽白血病病毒的方法。

背景技術

禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)是可引起禽類患多種腫瘤性免疫抑制疾病的反轉錄病毒。該病毒根據其囊膜蛋白特征可分為A-J共10個亞群，而A，B，C，D以及J亞群可引起雞群患不同類型腫瘤的禽白血病病毒，這些病毒具有垂直和水平傳播的能力。其中C，D亞群十分罕見。國內目前最常見的是J亞群，其次是A亞群和B亞群。患病雞只常表現出產蛋率下降，消瘦，雞只胴體廢棄，雞只死亡等，導致國內乃至世界范圍內養禽業的巨大經濟損失。因ALV無特效藥物治療，也沒有疫苗可以使用，目前該病原的防控主要采取淘汰陽性雞群的凈化措施。ALV病毒分離鑒定的金標準是待檢樣品接種雞胚成纖維細胞DF-1細胞系，維持7-9天后，以抗ALV群特異性抗原p27單克隆抗體進行間接免疫熒光(IFA)或者ELISA進行確診。這種方法雖然可靠性高，但是耗時長。本發明利用雞肝細胞作為ALV病毒分離細胞。與傳統的DF1細胞比較，ALV在雞肝細胞上的病毒滴度顯著提高；ELISA檢測時，感染的雞肝細胞維持培養5天與DF-1細胞維持培養7天的效果相當或更佳。因此，利用能夠高效擴增J亞群禽白血病病毒的雞肝細胞作為病毒分離檢測用細胞，將加快ALV的凈化進程，節約時間、成本，在ALV凈化檢測中具有良好的應用前景。

發明內容

本發明的目的是在于提供一種高效擴增禽白血病病毒的方法，并實現提早檢測到禽白血病病毒病原。本發明利用病毒復制速率顯著高于DF-1細胞的雞肝細胞來擴增J亞群禽白血病病毒，利用雞肝細胞可以更早產生高滴度病毒的特性，實現提早檢測到病原。

本發明公開了可以高效擴增禽白血病病毒的雞肝細胞。本發明還公開雞肝細胞高效提高擴增J亞群禽白血病病毒的滴度，而且可以使ELISA檢測分離病原時間大幅縮短，實現提早檢測到禽白血病病原。

為實現上述發明目的，本發明提供的技術方案是：

一種高效擴增J亞群禽白血病病毒的方法，包括以下步驟：

1)雞肝細胞的培養；

2)雞肝細胞高效擴增J亞群禽白血病病毒：將雞肝細胞接種培養，在匯合度為70％時，

將J亞群禽白血病病毒接種細胞，以含2％胎牛血清的培養基培養；

3)J亞群禽白血病病毒的測定。

步驟1)中，雞肝細胞采用含10％胎牛血清的DMEM培養基進行培養。

步驟1)中，待細胞長滿單層后，用PBS洗滌一遍后，以0.25％的胰酶進行消化、傳代至所需的細胞培養板中。

步驟2)中，將雞肝細胞接種培養，在匯合度為70％時，將J亞群禽白血病病毒接種細胞，MOI為0.001，做兩個重復，以含2％胎牛血清的培養基培養7天，每天收集200μl上清凍于-80℃冰箱備用，同時每孔補200μl含2％胎牛血清的培養基。

步驟3)中，測定收集上清的TCID₅₀；利用GraphPad Prism 5軟件繪制J亞群禽白血病病毒生長曲線。

雞肝細胞能高效擴增J亞群禽白血病病毒，病毒效價可高達1.58×10⁷TCID₅₀/ml；