[發(fā)明專利]一種生物酶催化制備（S）?環(huán)氧乙烷苯二醇的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710935113.4
• 申請(qǐng)日: 2017-10-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107488684A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 畢康平;姚全才;張雪健;韓玉峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P17/02
• 分類號(hào): C12P17/02;C12N9/08
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種生物酶催化制備（S）-環(huán)氧乙烷苯二醇的方法，其特征在于用豆莢過(guò)氧化物酶催化制備(S)-2-氯-4-硝基-5-（環(huán)氧乙烷-2-基）苯-1,3-二醇，底物為(S)-2-氯-5-（環(huán)氧乙烷-2-基）苯-1,3-二醇，底物的ee%為94-97.5%；生產(chǎn)的目標(biāo)產(chǎn)物為(S)-2-氯-4-硝基-5-（環(huán)氧乙烷-2-基）苯-1,3-二醇，反應(yīng)介質(zhì)為水-正戊醇，其中水相為pH6.8的磷酸鹽緩沖液，水相：正戊醇=75：25，將底物溶入正戊醇，然后加入反應(yīng)器，反應(yīng)溫度52-54℃，反應(yīng)時(shí)間為7.6-8.5h，豆莢過(guò)氧化物酶濃度為4-5mU/ml，底物濃度為30mM，NaNO₂濃度為350mM，H₂O₂采用流加的加料方式，反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，加入H₂O₂，使其濃度為8.5mM，啟動(dòng)酶催化反應(yīng)；然后開(kāi)始流加，用蠕動(dòng)泵加入H₂O₂，使?jié)舛染S持在7.5-9.5mM；反應(yīng)結(jié)束后，得到目標(biāo)產(chǎn)物，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，減壓蒸出有機(jī)溶劑，得到產(chǎn)物；底物轉(zhuǎn)化率為94.8-95.4%，目標(biāo)產(chǎn)物ee%為94-97.5%，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率為82.9-83.7%。

2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述豆莢過(guò)氧化物酶的提取方法為：

新鮮大豆莢用粉碎機(jī)粉碎后，粒度小于1mm，加5倍大豆莢質(zhì)量的去離子水室溫下浸泡4小時(shí)，過(guò)濾浸泡液，得到初提液，初提液體積V；攪拌中對(duì)初提液加入固體硫酸銨，使成45%飽和度，此時(shí)體積為V1；繼續(xù)攪拌中再加入0.3V的預(yù)冷丙酮，經(jīng)5000rpm，10分鐘離心，得到上清液1，對(duì)上清液1加入固體硫酸銨，按V1體積計(jì)算加到75%飽和度，經(jīng)5000rpm，10分鐘離心；此時(shí)，在水相與丙酮相界面處將形成一層沉淀，即沉淀1，取沉淀1，加入沉淀1體積5倍的去離子水溶解沉淀1，超濾脫鹽后，經(jīng)5000rpm，10分鐘離心，得到上清液2，上清液2體積V2，取上清液2，用丙酮分級(jí)沉淀：對(duì)上清液2先加1.0V2體積預(yù)冷丙酮，經(jīng)5000rpm，10分鐘離心，得到上清液3，對(duì)上清液3再加0.8V2體積丙酮，經(jīng)5000rpm，10分鐘離心，得到沉淀2;減壓抽干沉淀2中的丙酮，加10倍沉淀2體積的去離子水溶解沉淀2，調(diào)pH到8.0，加1mol/L硫酸鋅，使硫酸鋅成0.01mol/L終濃度，經(jīng)5000rpm，10分鐘離心，得上清液4；將上清液4調(diào)pH至7，用超濾脫鹽濃縮，冷凍干燥，得到豆莢過(guò)氧化物酶粉，酶活為30-40U/mg；

用干豆莢也可提取豆莢過(guò)氧化物酶，方法如下：干大豆莢，加12倍干大豆莢質(zhì)量的去離子水浸泡1小時(shí)，用粉碎機(jī)粉碎后，4℃浸泡過(guò)夜，將浸泡液過(guò)濾后，得到初提液，初提液體積V；其余步驟同鮮豆莢。