[發明專利]用于改善的蛋白質分泌的表達載體

有效

• 申請號: 201710933102.2
• 申請日: 2012-05-25
• 公開（公告）號: CN107574177B
• 公開（公告）日: 2022-01-11
• 發明（設計）人: C·德格林;T·埃格特;S·埃弗斯;K-H·莫勒;J·邦蓋爾茨
• 申請（專利權）人: 巴斯夫歐洲公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/74;C12N15/75;C12N15/77;C12N9/50;C12N1/21
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 柴云峰;黃革生

本發明的目的是改善宿主細胞的蛋白質分泌以增加發酵過程中的蛋白質產量。這是通過表達載體實現的，所述表達載體包含a)啟動子序列和b)編碼蛋白質的核酸序列。蛋白質包含信號肽和額外的氨基酸序列，并且信號肽包含與SEQ ID NO.2中說明的氨基酸序列至少80％相同，與SEQ ID NO.4中說明的氨基酸序列至少80％相同，或與SEQ ID NO.6中說明的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或者信號肽包含與所述序列中的至少一個在結構上同源的氨基酸序列。

本申請是申請日為2012年5月25日、發明名稱為“用于改善的蛋白質分泌的表達載體”的中國專利申請201280026365.0(國際申請號PCT/EP2012/059901)的分案申請。

本發明屬于生物技術的領域，更特別是微生物蛋白質合成的領域。本發明尤其涉及用于制備蛋白質的表達載體，并另外提出了包含此類表達載體的宿主細胞。本發明還涉及此類表達載體和宿主細胞用于蛋白質制備的方法和用途。

為了制備蛋白質，可以利用表達目標蛋白的基因的宿主細胞，更特別是微生物。一般以使其表達的方式將目標蛋白的基因(轉基因)導入到宿主細胞中。常見的是其與一個或多個允許基因表達的啟動子序列(啟動子)共同存在于所謂的表達載體上。

為了工業規模的生物技術生產，在發酵罐中培養所討論的宿主細胞，根據細胞的代謝特性調整發酵罐。在培養過程中，宿主細胞代謝所供應的底物，并形成理想的產物，所述產物在發酵結束后通常與生產生物分離，并從發酵罐漿和/或發酵基質中純化和/或濃縮。

固有地在發酵中獲得非常高的產量是理想的。產量依賴于多種因素，例如除實際需要的產物外，宿主細胞通常形成多種一般非目的性的其他物質。此外，轉基因的表達及產物的產量基本上取決于所使用的表達系統。例如，國際專利申請WO 91/02792公開了在優化的地衣芽孢桿菌中，在來自地衣芽孢桿菌的基團調控序列的控制下，更特別是地衣芽孢桿菌的啟動子的控制下，來自遲緩芽孢桿菌的堿性蛋白酶的改善的發酵生產。

為了工業生產蛋白質，例如水解酶，優選使用能夠將大量蛋白質分泌到培養上清中的宿主細胞，使得不必進行復雜的細胞破碎，所述復雜的細胞破碎對于胞內生產是必需的。出于該目的，優選使用這樣的宿主細胞，例如芽孢桿菌屬物種，其可以在有效的高細胞密度發酵方法中使用有成本效益的培養基培養，并能夠將大量克/升的靶蛋白質分泌到培養上清中。通常，由表達載體表達待分泌的蛋白質，所述表達載體已經被導入到宿主細胞中并且編碼待分泌的蛋白質。經表達的蛋白質通常包含使其從宿主細胞輸出的信號肽(信號序列)。信號肽通常是在宿主細胞中翻譯的多肽鏈的一部分，但其還可以在宿主細胞內或外，從蛋白質上翻譯后切割掉。

尤其是對于異源蛋白質的胞外生產，然而存在多種瓶頸，并且相應的非常需要優化分泌過程。瓶頸之一是選擇允許靶蛋白從宿主細胞有效輸出的信號肽。原則上，信號肽可以是與蛋白質，更特別是與酶新組合的。例如Brockmeier等人的出版物(J.Mol.Biol.362，第393–402頁(2006))描述了使用角質酶的實例分泌信號肽文庫的策略。然而，不是每個信號肽也在發酵條件下，更特別是在工業或工業規模的發酵條件下，帶來充足的蛋白質輸出。

因此，本發明的目標是改善宿主細胞的蛋白質分泌，以及結果為增加發酵方法中的蛋白質產量。

本發明提供了表達載體，包含

a)啟動子序列，和

b)編碼蛋白質的核酸序列，蛋白質包含信號肽和另外的氨基酸序列，信號肽包含與SEQ ID NO.2中說明的氨基酸序列至少80％相同，或與SEQ ID NO.4中說明的氨基酸序列至少80％相同，或與SEQ ID NO.6中說明的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或者信號肽包含與這些序列中的至少一個在結構上同源的氨基酸序列。

令人驚訝地發現，編碼具有此類信號肽的蛋白質的表達載體實現了含有表達載體并且表達核酸序列b)的宿主細胞的改善的蛋白質分泌。結果是在本發明的優選的實施方案中，能夠增加發酵方法中的蛋白質產量。