[發明專利]自然殺傷細胞培養基質及自然殺傷細胞的擴增培養方法

有效

• 申請號: 201710932046.0
• 申請日: 2017-10-09
• 公開（公告）號: CN107488631B
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 徐永勝;楊瑩;金星
• 申請（專利權）人: 天津長和生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 吳開磊

1.一種自然殺傷細胞的擴增培養方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

步驟1：使用X-VIVO 15:AlyS505NK-AC＝1:1的無血清培養基重懸人源外周血單個核細胞，并將培養基中的細胞濃度調整至1.5×10⁶/mL，隨后接種至包被有Lymactin-NK抗體的細胞培養瓶中；

步驟2：將自體血漿加入步驟1細胞培養瓶中，自體血漿在自然殺傷細胞培養基質中的濃度為5％，并添加細胞因子：IL-2 1000IU/mL，IL-7 20ng/mL，IL-12 5ng/mL，IL-15 20ng/mL，IL-21 10ng/mL，隨后進行誘導培養14天；

步驟3：在誘導培養過程中前7天，每3天進行一次補液，使用補液培養基調整細胞密度為1.5×10⁶/mL，并補加自體血漿和IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21細胞因子；在誘導培養過程中后7天，每3天進行一次補液，使用補液培養基調整細胞密度為1.5×10⁶/mL，并補加IL-2和IL-15細胞因子；

步驟4：在誘導培養14天時收集自然殺傷細胞，將收集到的自然殺傷細胞用PBS緩沖液清洗3次，得到自然殺傷細胞；

所述步驟1包被有Lymactin-NK抗體的細胞培養瓶的制備方法為：將濃度為0.6mg/mL的Lymactin-NK抗體包被在細胞培養瓶中，包被條件為37℃，孵育時間為2h，得到包被后的細胞培養瓶；

所述步驟2自體血漿的制備方法為：采集外周血，將采集的外周血轉移至50mL離心管中，在2000rmp，20℃的離心條件下離心10分鐘得到步驟2自體血漿；

所述步驟1人源外周血單個核細胞的制備方法為：采集外周血，將采集的外周血轉移至50mL離心管中，在2000rmp，20℃的離心條件下離心10分鐘得到自體血漿，隨后使用淋巴細胞分離液分離并收集人源外周血單個核細胞，然后將收集到的人源外周血單個核細胞用PBS緩沖液清洗三次，得到步驟1人源外周血單個核細胞；其中，使用淋巴細胞分離液分離并收集人源外周血單個核細胞的步驟具體包括：

1、將吸取自體血漿后的血液樣本按照1：1的比例加入PBS，混勻；

2、將稀釋后的血液樣本緩慢加在淋巴細胞分離液面上，稀釋后的血液樣本與淋巴細胞分離液的比例為1：1；

3、離心，轉速2000rpm，時間15min，慢升慢降，離心溫度為20℃；

4、離心后吸取單個核細胞層細胞。