[發明專利]人NOS3基因第61位點的單核苷酸多態性及其應用

在審

• 申請號: 201710930816.8
• 申請日: 2017-10-09
• 公開（公告）號: CN107502669A
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發明（設計）人: 王思捷
• 申請（專利權）人: 王思捷
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學和醫學領域，具體涉及人NOS3基因第61位點的單核苷酸多態性及其與類風濕關節炎相關性的檢測；本發明還涉及該位點的實時熒光定量PCR檢測試劑盒和方法。

背景技術

類風濕關節炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一種系統性自身免疫性疾病，以關節的炎癥為主要特點，主要的病理變化為慢性滑膜炎和血管炎，當累及關節軟骨和骨質時，逐漸形成關節畸形和強直，導致關節功能喪失。盡管RA的發病機制至今尚未完全闡明，但目前普遍認為RA的發生是具備遺傳易感性的個體在各種危險因素的刺激下誘導機體免疫功能紊亂進而打破自身免疫耐受所致。迄今為止，研究發現了幾十個與RA遺傳易感性相關的易感區域/位點，因此RA相關基因的多態性特別是占多數的單核苷酸位點多態性研究顯得十分重要。然而已報道的RA相關基因位點多態性大多數是在歐美人群中開展的，亦有在韓國、日本與北印度等亞洲人群中開展的。不同種族人群間的RA遺傳易感位點既有共同部分也有特異部分。目前尚未見我國RA單核苷酸多態性的系統研究。

一氧化氮（nitric oxide, NO）在RA的發病機制中起到重要。NO由L-精氨酸胍基末端的氮原子與分子氧在NOS的催化下合成，而NOS是該反應唯一的限速酶，NOS3是其中重要的一種。研究表明，NOS3基因與RA、Behcet’s病、系統性紅斑狼瘡(SLE)、I型糖尿病等多種自身免疫性疾病相關。Sanger測序是基因分析的黃金標準，也是基因單核苷酸多態性分析的重要手段；而實時熒光定量PCR可以對特定的單核苷酸多態性位點進行檢測，具有靈敏度高、檢測快速且很好地避免污染的優點。本發明通過對RA家族中NOS3基因第1外顯子片段的Sanger測序分析，新發現了其第61位點的特定單核苷酸多態性尚未見報道，并通過構建的實時熒光定量檢測方法在人群樣本中進行了進一步的驗證。

發明內容

為了克服現有中國人群類風濕關節炎的易感基因多態性位點缺乏解析的不足，本發明的目的之一在于提供人NOS3基因特定位點單核苷酸多態性，本發明的另一目的在于提供人NOS3基因第61位點單核苷酸多態性的檢測試劑盒和方法。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案為，人NOS3基因第61位點的單核苷酸多態性，其特征在于第61位點的單核苷酸為A核苷酸或G核苷酸即61A/G，其中健康人群NOS3基因第61位點均為A核苷酸，類風濕關節炎人群NOS3基因第61位點為G核苷酸的比例高達20%，兩者具有顯著性的人群分布差異；NOS3基因第61位點為G核苷酸其所在片段對應的序列如SEQ ID NO.1所示，第61位點為A核苷酸其所在片段對應的序列如SEQ ID NO.2所示。需要指出的是由于是DNA序列，本發明的的A或A核苷酸指的是腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，G或G核苷酸指的是鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸。

本發明提供的人NOS3基因第61位點的A/G核苷酸多態性檢測試劑盒為實時熒光定量PCR試劑盒，可以用于檢測人NOS3基因第61位點的A核苷酸或G核苷酸中的至少一個，該試劑盒包含特異性設計的上下游引物和兩種TaqMan探針，其中上下游引物P1和P2序列分別如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，兩種TaqMan探針T1和T2序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，分別對應NOS3基因第61位點的A和G核苷酸,其中T1探針其5’端標記FAM熒光基團，而T2探針其5’端標記HEX熒光基團，此兩種探針3’端均標記TAMRA熒光淬滅基團。此外，本發明的實時熒光定量PCR試劑盒還包括定量PCR預混液，是預先混合好了的定量PCR緩沖液、dNTP混合液和耐熱DNA聚合酶的混合液，可向商業化生物公司購買。

對應于本發明提供的人NOS3基因第61位點的單核苷酸多態性檢測試劑盒，本發明的實時熒光定量PCR檢測方法其體系為：2×定量PCR預混液10.0μL，上下游引物P1和P2的終濃度均為1μmol/L，TaqMan探針T1和T2的終濃度均為1.5μmol/L，基因組DNA終濃度不少于10ng/μL，滅菌蒸餾水補足至反應總體積為20μL。實時熒光定量PCR檢測條件為：95℃預變性3min，再95℃變性15s，60℃退火及延伸45s，循環50次。

本發明提供了人 NOS3基因第61位點的A/G核苷酸多態性，并揭示了其與類風濕關節炎易感性的關聯，在此基礎上構建其快速特異實時熒光定量檢測試劑盒和方法，這些可以為中國人群類風濕關節炎的易感性機制解析、易感基因檢測和精準診治提供基礎。

附圖說明