[發明專利]用于曼氏無針烏賊家系鑒定的微衛星標記及應用

在審

• 申請號: 201710930753.6
• 申請日: 2017-10-09
• 公開（公告）號: CN107557479A
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發明（設計）人: 郭寶英;祁鵬志;吳常文
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙)33213
• 代理人: 吳秉中

1.用于曼氏無針烏賊家系鑒定的微衛星標記，其特征在于：所述微衛星標記的核苷酸序列為SEQ ID No:1-19。

2.根據權利要求1所述的用于曼氏無針烏賊家系鑒定的微衛星標記，其特征在于：所述微衛星標記的篩選方法包括以下步驟：

1)基因組DNA的提取：提取曼氏無針烏賊基因組DNA，用限制酶Mbol將基因組DNA酶切，回收400-1000bp DNA片段；

2)連接產物的制備：將接頭A(5'-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT-3')和接頭B(5'-GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC-3')等比例混合，接著與酶切回收DNA片段連接，得連接產物；

3)連接產物的擴增：以連接產物為模板，以接頭B為引物進行PCR擴增；

4)鏈霉素磁珠捕捉：取連接產物的擴增產物與生物素探針(CA)12（20mmol/L）雜交，加入包被有鏈霉素的磁珠混合，除去雜交混合液；

5)DNA片段的洗脫：將磁珠加入到TE緩沖液，在95℃保溫5min，分離磁珠，得到含有微衛星DNA片段的上清液；

6)洗脫片段的擴增：以接頭B為引物，以含有微衛星DNA片段的上清液為模板，進行PCR擴增，純化PCR擴增產物，接著與pMD18-T載體連接，轉化DH5α感受態細胞，涂布于含有IPTG、X-Gal和氨芐青霉素的LB平板，37℃培養過夜，以菌液為模板進行PCR擴增，檢測，測序；

7)微衛星標記的獲取：根據測序所得微衛星兩端的側翼序列設計引物，對引物的5'端用FAM修飾，幷以曼氏無針烏賊基因組DNA為模板進行PCR擴增反應，將各PCR產物在6％變性聚丙烯酰胺凝膠上檢測各引物多態性，篩選出非特異性條帶擴增少、結果穩定、多態性豐富的微衛星標記20個，其核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.20所示。

3.根據權利要求2所述的用于曼氏無針烏賊家系鑒定的微衛星標記，其特征在于：所述步驟1)中酶切溫度為37℃，酶切時間為3h。

4.根據權利要求2所述的用于曼氏無針烏賊家系鑒定的微衛星標記，其特征在于：所述步驟2)中混合溫度為95℃，混合時間為10min。

5.根據權利要求2所述的用于曼氏無針烏賊家系鑒定的微衛星標記，其特征在于：所述步驟4)中雜交條件為：先在95℃變性5min，然后在65℃雜交60min。

6.根據權利要求2所述的用于曼氏無針烏賊家系鑒定的微衛星標記，其特征在于：所述步驟7)中引物設計條件為：GC含量為40%-60%，退火溫度為48-60℃，引物長度為18bp-24bp。

7. 核苷酸序列為SEQ ID No:1-19的微衛星標記在曼氏無針烏賊家系鑒定中的應用，其特征在于核苷酸序列為SEQ ID No:1-19的微衛星標記用于鑒定曼氏無針烏賊家系中的用途。