[發明專利]同時鑒別美洲型PRRSV經典毒株、變異毒株及新型病毒類NADC30毒株的檢測方法

有效

• 申請號: 201710919048.6
• 申請日: 2017-09-30
• 公開（公告）號: CN107475459B
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 吳家強;劉艷艷;于江;王淞;楊杰;李建達;曾昊;陳智
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 濟南克雷姆專利代理事務所(普通合伙) 37279
• 代理人: 張祥明

1.同時鑒別美洲型PRRSV經典毒株、變異毒株及新型病毒類NADC30毒株的熒光PCR檢測引物組合物，其特征在于，包括：

(1)高致病變異毒株HP-PRRSV的特異引物，其核苷酸序列如下：

正向引物序列HP-PRRSVF：5'-GACGTGCCCCCAAGCTGAT-3'，如SEQ ID NO.1所示；

反向引物序列HP-PRRSVR：5'-GGATGCCCATGTTCTGCGA-3'，如SEQ ID NO.2所示；

(2)經典毒株Classical-PRRSV的特異引物，其核苷酸序列如下：

正向引物序列C-PRRSVF：5'-TGGGAAGATTTGGCTGTTAGT-3'，如SEQ ID NO.3所示；

反向引物序列C-PRRSVR：5'-TCACCTGCTGAAACTTACGC-3'，如SEQ ID NO.4所示；

(3)新變異類NADC30型毒株的特異引物，其核苷酸序列如下：

正向引物序列NA-PRRSVF：5'-CGTATTGGACACCTCTTTTGACTG-3'，如SEQ ID NO.5所示；

反向引物序列NA-PRRSVR：5'-AACTGGACCTAATCTTCCTGCG-3'，如SEQ ID NO.6所示；

(4)美洲型毒株通用引物，其核苷酸序列如下：

正向引物序列PRRSV-UF：5'-TCCAGATGCCGTTTGTGCTT-3'，如SEQ ID NO.7所示；

反向引物序列PRRSV-UR：5'-CCCAACACGAGGCTTTTCAA-3'，如SEQ ID NO.8所示。

2.同時鑒別美洲型PRRSV經典毒株、變異毒株及新型病毒類NADC30毒株的熒光PCR檢測探針組合物，其特征在于，包括：

高致病變異毒株HP-PRRSV的特異性探針，其核苷酸序列如下：

HP-PRRSVP：5'-CGTAGAACTGTGACAACAACGCTGAC-3'，如SEQ ID NO.9所示；

經典毒株Classical-PRRSV的特異性探針，其核苷酸序列如下：

C-PRRSVP：5'-ATGCATCTTCAGGCCGGCGA-3'，如SEQ ID NO.10所示；

新變異類NADC30型毒株的特異性探針，其核苷酸序列如下：

NA-PRRSVP：5'-CCCAAAGGTCTTCGTCGGTATTCC-3'，如SEQ ID NO.11所示；

美洲型毒株通用特異性探針，其核苷酸序列如下：

PRRSV-UP：5'-TCTGGCCCCTGCCCACCA-3'，如SEQ ID NO.12所示。

3.根據權利要求2所述的探針組合物，其特征在于，所述探針序列的5’端修飾有報告基團，3’端修飾有淬滅基團，其中所述的四種探針的報告基團分別為FAM、JOE、ROX、CY5不同熒光素修飾，所述淬滅基團為Dabcyl、BHQ1，BHQ2中的任一種。

4.同時鑒別美洲型PRRSV經典毒株、變異毒株及新型病毒類NADC30毒株的熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的熒光PCR檢測引物組合物、權利要求2所述的探針組合物、陽性對照標準品和多重實時熒光PCR反應擴增體系。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陰性對照品，為無RNA酶水。

6.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照標準品為經典毒株Classical-PRRSV、高致病變異毒株HP-PRRSV、新變異類NADC30型毒株的NSP2基因的一段標記性序列的重組質粒。

7.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述多重實時熒光PCR反應擴增體系采用20μL反應體系，包括：2×TaqMan Master Mix 10μL，引物組合物終濃度5μM，探針組合物終濃度1～5μM，cDNA用量1～50ng/μL取2μL，用雙蒸水補足20μL。

8.同時鑒別美洲型PRRSV經典毒株、變異毒株及新型病毒類NADC30毒株的目的基因序列，其特征在于，包括：

高致病變異毒株NSP2基因目的序列171bp，其核苷酸序列如下：

Cccgcgtcgcgacgtgcccccaagctgatgacacctttgagtgggccggcaccagttcctgcaccgcgtagaactgtgacaacaacgctgacgcaccaggatgagcctctggatttgcctgcgtcctcacagacggaatatgaggctttccccctagcaccatcgcagaacatgggcatcct，如SEQ ID NO.13所示；

和PRRSV經典毒株NSP2基因目的序列232bp，其核苷酸序列如下：

Gttgggaagatttggctgttagtagcccctttgatctcccggccccacctgagccggcaacaccttcaagtgagctggtgattgtgtcctcaccgcaatgcatcttcaggccggcgacacccttgagtgagccggctccaattcccgcacctcgcggaactgtgtctcgaccggtgacacccttgagtgagccgatccctgtgcccgtaccgcggcgtaagtttcagcaggtgaaaagattgagttcgg，如SEQ ID NO.14所示；

和PRRSV類NADC30型毒株NSP2基因目的序列213bp，其核苷酸序列如下：

Gcttggctaggcttgagaaagctcgcccgccaaacgtattggacacctcttttgactgggatgtcgtgcttcctggagttggagtggctgcccaagcagcagaactgcccctcatcaaccggtatcacgctccaaccactgttgtagcccaaaggtcttcgtcggtattccagtctcgaaaagcggaatctgtcaggagccttccagagaacaggcctctccctgccccacgcaggaagattaggtccagttgtggtagtttggtttcattgggcggcaatttccctgacagctgggaagatgcggccg，如SEQ ID NO.15所示；

和PRRSV美洲型通用型引物N基因目的產物194bp，其核苷酸序列如下：

TCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTCGAAAGTGCCGCGGGCTTTCATCCGATTGCGGCAAATGATAACCACGCATTTGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCAACGGCACATTGGTGCCCGGGTTGAAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAAGCAGGGAGTGGTAAACCTTGTTAAATATGCCAAAATGCCAAATAACAACGGCAAGC，如SEQ ID NO.16所示。