[發明專利]一種體外產生環狀核酸分子的方法

在審

• 申請號: 201710917265.1
• 申請日: 2017-09-30
• 公開（公告）號: CN109593783A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發明（設計）人: 王皓毅;程晨;唐娜;李佳鑫;操時偉
• 申請（專利權）人: 中國科學院動物研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/64;C12N15/67
• 代理公司: 北京永新同創知識產權代理有限公司 11376
• 代理人: 欒星明;程大軍

1.一種產生包含靶核苷酸序列的環狀核酸分子的方法，所述方法包括：

a)提供多種包含所述靶核苷酸序列的線性核酸分子的混合物，所述多種線性核酸分子每種在兩端包含獨特的互補單鏈突出末端；

b)用核酸連接酶如T4連接酶使所述混合物中的線性核酸分子通過其互補單鏈突出末端而自身連接，由此自身環化形成環狀核酸分子。

2.權利要求1的方法，其中所述單鏈突出末端包含2個、3個、4個、5個或6個或更多個核苷酸。

3.權利要求1或2的方法，其中步驟a)中提供2-8種、2-32種、2-128種、2-512種、或2-2048種或更多種包含所述靶核苷酸序列的線性核酸分子的混合物。

4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述混合物中每種線性核酸分子的濃度為0.01-20ng/μl，優選0.01-10ng/μl，更優選0.01-5ng/μl，更優選0.01-2.5ng/μl，更優選0.01-1ng/μl。

5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述混合物中線性核酸分子的總濃度為0.01-200ng/μl或更高。

6.權利要求1-5中任一項的方法，其進一步包括：

c)使用核酸外切酶例如T5核酸外切酶去除混合物中的線性核酸分子。

7.權利要求1-6中任一項的方法，其中a)中通過以下步驟提供所述多種線性核酸分子的混合物：

1)提供包含所述靶核苷酸序列的線性核酸分子；

2)將多組接頭對分別連接至所述線性核酸分子，所述多組接頭對每組包含5’接頭和3’接頭且所述5’接頭和3’接頭包含獨特的互補單鏈突出末端；

3)混合并任選地純化步驟2)中的產物。

8.權利要求1-6中任一項的方法，其中a)中通過以下步驟提供所述多種線性核酸分子的混合物：

1)用多組靶特異性引物對分別擴增獲得包含所述靶核苷酸序列的線性核酸分子，每組所述引物對中的引物在5’端包含能被限制性內切酶切割并形成獨特的互補單鏈突出末端的序列；

2)混合并任選地純化步驟1)的擴增產物；

3)用所述限制性內切酶消化步驟2)獲得的混合物；和

4)任選地純化步驟3)的消化產物。

9.權利要求1-6中任一項的方法，其中a)中通過以下步驟提供所述多種線性核酸分子的混合物：

1)用包含通用序列標簽的靶特異性引物對擴增獲得包含所述靶核苷酸序列的線性核酸分子，

2)用多組針對所述通用序列標簽的引物對分別擴增步驟1)獲得的線性核酸分子，每組所述引物對中的引物在5’端包含能被限制性內切酶切割并形成獨特的互補單鏈突出末端的序列；

3)混合并任選地純化步驟2)的擴增產物；

4)用所述限制性內切酶消化步驟3)獲得的混合物；和

5)任選地純化步驟4)的消化產物。

10.權利要求8或9的方法，其中所述限制性內切酶是BbsI。

11.權利要求10的方法，所述引物對中的兩種引物分別在5’端包含5’-GAAGACNNN₁N₂N₃N₄-3’和5’-GAAGACNNN₅N₆N₇N₈-3’的序列，其中N代表A、T、C和G中任一個，且序列N₁N₂N₃N₄與序列N₅N₆N₇N₈反向互補。

12.權利要求1-11中任一項的方法，其中所述環狀核酸分子是minicircle DNA。