[發明專利]一種發酵產低色素黃原膠的方法

在審

• 申請號: 201710916896.1
• 申請日: 2017-09-30
• 公開（公告）號: CN107686822A
• 公開（公告）日: 2018-02-13
• 發明（設計）人: 劉詠梅;王中華;郁曉君;顧秋亞;余曉斌;劉明源;宗春燕;周琳;吳貴嬌
• 申請（專利權）人: 泰州職業技術學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P19/06;C12R1/64
• 代理公司: 南京正聯知識產權代理有限公司32243
• 代理人: 盧霞

技術領域

本發明公開了一種采用野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)1.1781細胞壁缺損型細胞發酵產低色素黃原膠的方法并且公開了獲得該菌株細胞壁壁缺損型細胞的方法。發酵產低色素黃原膠方法具體涉及對該菌株發酵培養的培養基配方及發酵條件。

背景技術

黃原膠(Xanthan gum)是經野油菜黃單胞菌或甘藍黑腐黃單胞菌利用碳水化合物為主要原料發酵獲得的一種酸性胞外多糖。它是一種高分子聚合物，主要由D-葡萄糖，D-甘露糖和D-葡萄糖糠醛以2:2:1的比例組成，同時含有2％—6％丙酮酸和4.5％乙酸。

黃原膠因其獨特的分子結構，而具有獨特的流變特性，良好的水溶性，并且耐酸堿，耐高溫，因黃原膠的各種優良特性使其在食品、造紙、飲料、化工、化妝品、石油開采等多個領域得到廣泛利用。

黃原膠產生菌由Jeanes等人于20世紀50年代篩選獲得，60年代初，由美國C.P.Kelco公司商業化。1969年，美國食品和藥品管理局(FDA)批準黃原膠可作為食品添加劑；1983年，世界糧農組織和衛生組織批準其在世界范圍使用。2010年黃原膠在全球總產量達到11萬噸，而中國總產量達到7.4萬噸，黃原膠已經成為生產量最大且用途最廣的微生物多糖。

黃原膠發酵菌株育種研究背景：Sutherland IW報道，篩選細胞壁合成缺陷菌株可能獲得黃原膠高產菌株。白先放等報道采用微波篩選無色素黃原膠產生菌。王桂蘭等報道在發酵培養基中加入表面活性劑可促進黃原膠發酵產量提高。傳統理論認為，表面活性劑可以抑制細胞膜脂肪酸的合成，從而改變細胞膜的組成成分及其通透性，使發酵產物更容易滲透出來，進而提高發酵產率。刁虎欣等報道通過溶菌酶獲得產黃原膠菌株原生質體，該原生質體在蔗糖為底物的高滲培養液中培養，能夠合成并分泌黃原膠。

本項專利介紹一種通過連續培養方式獲得細胞壁缺損型野油菜黃單胞菌突變株的方法，該方法不使用表面活性劑、也未使用溶菌酶。

對菌株進行連續傳代培養策略方案的來源：本發明發明人自2014年開始熱凝性多糖研究，Tokuya Harada教授在一篇名為“the story ofResearch into Curdlan and the Bacteria Produing it”的論文中提到，發酵產可到然膠原始菌株10C3最初產的是一種水溶性多糖，經過2年的菌種傳代培養后，菌株發生突變，發酵產物變成了一種水不溶性多糖，即可得然膠。

本研究室在進行黃原膠發酵研究的過程中，嘗試對菌株野油菜黃單胞(Xanthomonas campestris)1.1781進行連續傳代培養，探索是否有可能發酵出熱凝性黃原膠；我們并未能查出日本Tokuya Harada教授團隊研究可得然膠過程中菌株傳代培養的配方；我們選擇的是通過初步培養基優化而能產出黃原膠的培養基配方，在該項研究過程中我們發現，經過5-6個月連續培養，該菌的細胞壁出現了缺損，具體表現為革蘭氏染色后細胞形態由桿狀變為圓形。采用該細胞缺損型菌株發酵可獲得低色素黃原膠且底物轉化率可達90％以上。

發明內容

本發明的一個目的，一種通過連續傳代的方式制備野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)1.1781細胞壁缺損型菌株的方法。本發明的特點是通過連續傳代的方式獲得野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)1.1781細胞壁缺損型菌株，該菌株經革蘭氏染色后普通顯微鏡下細胞為圓形而不是桿狀(出發菌革蘭氏陰性桿菌)。不同于傳統紫外誘變、亞硝基胍誘變、也沒有添加表面活性劑、EDTA、SDS或溶菌酶等物質，本發明為獲得細胞壁缺損型野油菜黃單胞菌提供了一種新的方法。該方法包括如下步驟：

第1步、斜面培養：將購自中國普通微生物保藏管理中心的野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)1.1781菌株劃線接種于斜面培養基中進行培養。斜面培養基中包含如下組分：20g/L葡萄糖，5g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，20g/L瓊脂，pH 6.5～7.5；培養溫度28～32℃，培養時間50～80小時。