[發(fā)明專利]一種補(bǔ)體C3檢測試劑盒的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710915596.1
• 申請日: 2017-09-30
• 公開（公告）號: CN107727867A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 莊慶華;朱衛(wèi)中;吳澤東;張金東;吳錚
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543;G01N33/544
• 代理公司: 合肥市浩智運(yùn)專利代理事務(wù)所(普通合伙)34124
• 代理人: 王志興

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種補(bǔ)體C3檢測試劑盒的制備方法。

背景技術(shù)

補(bǔ)體C3是由α和β兩條肽鏈通過二硫鍵連結(jié)組成，為β1球蛋白，分子量180kD，含糖量約占2.2％，是血清中含量最多的補(bǔ)體成分，約占總補(bǔ)體含量的1/3以上。在補(bǔ)體系統(tǒng)激活過程中，無論是經(jīng)典途徑還是旁路途徑，均需C3活化后才能推進(jìn)后續(xù)補(bǔ)體成分(C5-C9)的連鎖反應(yīng)。因此，它在兩條激活途徑中起關(guān)鍵作用。補(bǔ)體C3主要在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞被合成分泌，少量由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞合成。生理情況下，體液中或組織炎癥部位存在的蛋白水解酶，可緩慢裂解C3，持續(xù)產(chǎn)生少量的C3b和C3轉(zhuǎn)化酶(C3bB)，一般可被I因子、H因子迅速滅活，故并不激活補(bǔ)體系統(tǒng)，一旦C3被激活物質(zhì)激活，C3b又可在B因子、D因子作用下合成新的C3bBb并進(jìn)一步使C3激活，裂解、釋放許多生物學(xué)活性片段，其結(jié)果可表現(xiàn)為增強(qiáng)機(jī)體的防御能力，亦可出現(xiàn)引起疾病的免疫病理作用。

C3的增多與減少基本與總補(bǔ)體活性相似，但更為敏感。補(bǔ)體C3在機(jī)體組織損傷和急性炎癥時，常增高或?yàn)檎＃缇Y、肺炎、扁桃腺炎、結(jié)核、傷寒、麻疹、流腦等；腫瘤患者，尤以肝癌，血清C3含量升高更為顯著，但胰腺癌晚期與隱性淋巴細(xì)胞白血病則呈降低趨勢。補(bǔ)體動態(tài)變化在臨床上越來越受到重視。抗原-抗體復(fù)合物引起的胃炎病人血清總補(bǔ)體和C3均明顯下降。大多數(shù)全身性紅斑狼瘡患者血清補(bǔ)體的降低和病情惡化有關(guān)。活動性全身性紅斑狼瘡患者血清中C1、C4、C2和C3降低，病情緩解時血清補(bǔ)體水平恢復(fù)正常。傳染病及組織損傷和急性炎癥時，C2、C3、C4均增加，總補(bǔ)體活性正常或升高，但晚期則降低。腫瘤患者補(bǔ)體量升高，特別是肝癌，C3升高最為明顯，具有診斷意義。胰腺癌晚期與隱性淋巴細(xì)胞白血病患者C3降低。肝臟疾病患者C3多為降低，腎移植病人C3的水平不穩(wěn)定，C3在排異反應(yīng)開始時升高，然后下降到正常以下。

目前，檢測血清補(bǔ)體C3的含量方法主要是普通的免疫比濁法，對補(bǔ)體C3含量檢測的試劑盒也多是基于此方法設(shè)計(jì)。免疫比濁法是抗原抗體結(jié)合動態(tài)測定方法，其基本原理是：當(dāng)抗原與抗體在一定稀釋系統(tǒng)中反應(yīng)且比例合適時，形成的可溶性免疫復(fù)合物在稀釋系統(tǒng)中的促聚劑的作用下，自液相析出，形成微粒，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度；當(dāng)抗體濃度固定時，形成的免疫復(fù)合物的量隨著檢樣中抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度也隨之增加；通過測定反應(yīng)液的濁度與一系列標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可計(jì)算出檢樣中抗原的含量。然而，該方法卻也存在一些弊端：靈敏度低、線性范圍窄，重復(fù)性差且不穩(wěn)定。

乳膠顆粒增強(qiáng)比濁法(PETIA)是近年來出現(xiàn)的一種較穩(wěn)定、準(zhǔn)確的體液蛋白均相免疫比濁法。PETIA法大體分為兩種：一種是散射比濁法；一種是透射比濁法；這兩種方法的基本原理相似，都是以高分子膠乳微球?yàn)檩d體的表面交聯(lián)相應(yīng)抗體，當(dāng)交聯(lián)有抗體的微球與抗原結(jié)合后，短時間內(nèi)可迅速聚集，改變反應(yīng)液的散光性能或透光性能，且反應(yīng)液散光性能或透光性能的改變與被測抗原的濃度相關(guān)，在一定范圍內(nèi)可以反映被測抗原的量。

PETIA法采用的乳膠顆粒多為惰性微球、羧基微球及氨基微球；微球表面的羧基或氨基與抗體的氨基端共價(jià)結(jié)合，形成的橋聯(lián)化學(xué)臂降低了位阻效應(yīng)，不僅提高了抗體的結(jié)合率，且為抗體提供合適的三維空間立體結(jié)構(gòu)，有效地保護(hù)抗體與抗原結(jié)合的活性區(qū)域；微球粒子直徑一般在20nm-4um，提高了檢測靈敏度。微球的推出可在一定程度上解決了臨床檢測的線性范圍窄、干擾因素多、實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性差等問題。

因此，目前急需一種基于乳膠顆粒增強(qiáng)比濁法的補(bǔ)體C3檢測試劑盒的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種檢測速度快、靈敏度高、線性范圍寬、重復(fù)性好且穩(wěn)定的補(bǔ)體C3檢測試劑盒的制備方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種補(bǔ)體C3檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

(1)按照下列組分含量配制試劑R1：

試劑R1：

其溶劑為純化水；

①按照上述試劑R1的組分含量，將Tris溶于純化水中，攪拌均勻，待充分溶解，配制成R1緩沖液；

②按照上述試劑R1的組分含量，將聚乙二醇8000、EDTA-Na、疊氮鈉溶于R1緩沖液中，攪拌均勻，再用1mol/L鹽酸或氫氧化鈉調(diào)pH至8.5，即制得試劑R1；

(2)按照下列組分含量配制試劑R2：

試劑R2：

其溶劑為純化水；